RSS

Transkripsi pada Prokaryotik

28 Apr

Transkripsi merupakan tahapan penting dalam sintesis protein atau ekspresi gen. Proses transkripsi terjadi pada nukleus (prokaryotik: nukleoid) di mana DNA diterjemahkan menjadi kode-kode dalam bentuk basa nitrogen membentuk rantai RNA yang bersifat single strain. Namun, pada rantai RNA yang terbentuk basa Timin digantikan dengan basa Urasil. Pada prokaryotik, rantai RNA langsung ditranslasikan sebelum transkripsi selesai. Sedangkan pada eukaryotik, rantai di bawa menuju sitoplasma (ribosom) untuk ditranslasi menjadi produk gen. Pembentukan RNA pada proses transkripsi melibatkan enzim RNA polymerase. Fungsi dasar kedua yang harus dijalankan oleh DNA sebagai materi genetik adalah fungsi fenotipik. Artinya, DNA harus mampu mengatur pertumbuhan dan diferensiasi individu organisme sehingga dihasilkan suatu fenotipe tertentu.  Fungsi ini dilaksanakan melalui ekspresi gen, yang tahap pertamanya adalah proses transkripsi, yaitu perubahan urutan basa molekul DNA menjadi urutan basa molekul RNA. Dengan perkataan lain, transkripsi merupakan proses sintesis RNA menggunakan salah satu untai molekul DNA sebagai cetakan (templat) nya.

Organisasi Gen Pada Prokaryot

Pada Umumnya, gen yang mengkode protein pada prokaryot berupa gen dengan copy tunggal (single copy), sedangkan gen yang mengkode tRNA dan rRNA berupa gen dengan jumlah copy banyak (multiple copies). Gen-gen pada prokaryot yang bertanggungjawab dalam jalur biokimia tertentu pada umumnya diorganisasikan dalam struktur operon. Suatu operon adalah organisasi beberapa gen structural yang ekspresinya dikendalikan oleh sutu promoter yang sama, contohnya operon lac yaitu operon yang mengendalikan kemampuan metabolism laktosa pada bakteri E.Coli.

Dalam operon lac terdapat tiga macam gen structural yang mengkode protein yang berbeda, yaitu gen Z (mengkode B galaktosidase), gen Y (mengkode permease) dan gen A (mengkode trans-asetilase). Masing-masing gen structural tersebut mempunyai kodon inisiasi (awal) dan kodon terminasi, tetapi ekspresinya dikendalikan oleh satu promoter yang sama. Pada waktu ditranskripsi, operon lac akan menghasilkan satu mRNA yang membawa kode-kode genetic untuk tiga macam polipeptida yang berbeda (disebut mRNA polisistronik). Dalam operon lac terdapat tiga macam gen structural yang mengkode tiga macam enzim, yaitu β-galaktosidase, permease dan trans-asetilase. Ketiga gen structural tersebut diatur ekspresinya oleh satu promoter yang sama (p). Operator adalah bagian dari promoter tempat penempelan protein repressor yang dikode oleh gen i.

Struktur RNA polimerase E. coli

Enzim RNA polimerase pada E. coli sekurang-kurangnya terdiri atas lima subunit, yaitu alfa (a), beta (b), beta prima (b’), omega(w), dan sigma (s). Pada bentuk lengkapnya, atau disebut sebagai holoenzim, terdapat dua subunit a dan satu subunit untuk masing-masing subunit lainnya sehingga sering dituliskan dengan a2bb’ws. Holoenzim RNA polimerase diperlukan untuk inisiasi transkripsi. Namun, untuk elongasi transkripsi tidak diperlukan faktor s sehingga subunit ini dilepaskan dari kompleks transkripsi begitu inisiasi selesai. Sisanya, yakni a2bb’w, merupakan enzim inti (core enzyme) yang akan melanjutkan proses transkripsi. Laju sintesis RNA oleh RNA polimerase E. coli dapat mencapai sekitar 40 nukleotida per detik pada suhu 37°C. Untuk aktivitasnya enzim ini memerlukan kofaktor Mg2+. Setiap berikatan dengan molekul DNA enzim RNA polimerase E. coli dapat mencakup daerah sepanjang lebih kurang 60pb. Meskipun kebanyakan RNA polimerase seperti halnya yang terdapat pada E. coli mempunyai struktur multisubunit, hal itu bukanlah persyaratan yang mutlak. RNA polimerase pada bakteriofag T3 dan T7, misalnya, merupakan rantai polipeptida tunggal yang ukurannya jauh lebih kecil daripada RNA polimerase bakteri. Enzim tersebut dapat menyintesis RNA dengan cepat, yaitu sebanyak 200 nukleotida per detik pada suhu 37°C.

 Subunit α (alfa)

Dua subunit a yang identik terdapat pada RNA polimerase inti. Kedua-duanya disandi oleh gen rpoA. Ketika bakteriofag T4 menginfeksi E.coli, subunit a akan dimodifikasi melalui ribosilasi ADP suatu arginin. Hal ini berkaitan dengan berkurangnya afinitas pengikatan promoter sehingga subunit a diduga kuat memegang peranan dalam pengenalan promoter.

 Subunit β (Beta)

Seperti halnya subunit a, subunit b juga terdapat pada RNA polimerase inti. Subunit ini diduga sebagai pusat katalitik RNA polimerase, yang dibuktikan melalui hasil penelitian mengenai penghambatan transkripsi menggunakan antibiotik. Antibiotik rifampisin merupakan inhibitor potensial bagi RNA polimerase yang menghalangi inisiasi tetapi tidak mempengaruhi elongasi. Kelompok antibiotik ini tidak menghambat polimerase eukariot sehingga sering digunakan untuk mengatasi infeksi bakteri Gram positif dan tuberkulosis. Rifampisin telah dibuktikan berikatan dengan subunit b, dan mutasi-mutasi yang menyebabkan resistensi terhadap rifampisin telah dipetakan pada gen rpoB, yaitu gen yang menyandi subunit b. Selanjutnya, kelompok antibiotik yang lain, yakni streptolidigin, ternyata menghambat elongasi transkripsi, dan mutasi-mutasi yang menyebabkan resistesi terhadap antibiotik ini juga dipetakan pada gen rpoB. Kedua hasil penelitian tersebut mendukung pendapat bahwa subunit b diduga mempunyai dua domain yang bertanggung jawab terhadap inisiasi dan elongasi transkripsi.

 Subunit b’

Subunit b’ juga terdapat pada RNA polimerase inti. Subunit yang disandi oleh gen rpoC ini mengikat dua ion Zn2+ yang diduga berpartisipasi dalam fungsi katalitik polimerase. Suatu polianion, yakni heparin, terbukti mengikat subunit b’. Heparin menghambat transkripsi secara in vitro dan juga berkompetisi dengan DNA dalam pengikatan RNA polimerase. Hal ini mendukung pendapat bahwa subunit b’ diduga bertanggung jawab terhadap pengikatan DNA cetakan.

Faktor s

Faktor s yang paling umum dijumpai pada E. coli adalah s70 (disebut demikian karena mempunyai berat molekul 70 kDa). Pengikatan faktor s pada RNA polimerase inti akan mengubah enzim tersebut menjadi holoenzim. Faktor s memegang peranan yang penting dalam pengenalan promoter tetapi tidak diperlukan untuk elongasi transkripsi. Kontribusi faktor s dalam pengenalan promoter adalah melalui penurunan afinitas enzim inti terhadap tempat-tempat nonspesifik pada molekul DNA hingga 104, disertai dengan peningkatan afinitas terhadap promoter.

Banyak organisme prokariot, termasuk E. coli, mempunyai beberapa faktor s. Semuanya terlibat dalam pengenalan kelompok-kelompok promoter tertentu. Faktor s dilepaskan dari RNA polimerase inti ketika sintesis RNA mencapai panjang 8 hingga 9 nukleotida. Enzim inti tersebut kemudian akan bergerak di sepanjang molekul DNA sambil menyintesis untai RNA. Sementara itu, faktor s dapat segera bergabung dengan RNA polimerase inti lainnya dan melakukan inisiasi transkripsi kembali.

Jumlah faktor s di dalam sel lebih kurang hanya 30% dari jumlah RNA polimerase inti sehingga hanya sepertiga di antara kompleks RNA polimerase yang akan dijumpai dalam bentuk holoenzim pada suatu waktu tertentu.

Promoter s70 pada E. coli

Seperti telah dikatakan di atas, promoter merupakan tempat tertentu pada molekul DNA yang mempunyai urutan basa spesifik untuk pengikatan RNA polimerase dan inisiasi transkripsi. Promoter yang berbeda akan dikenali oleh faktor s RNA polimerase yang berbeda pula. Meskipun demikian, faktor s yang paling umum dijumpai pada E. coli adalah s70. Promoter pertama kali dikarakterisasi melalui percobaan mutasi yang meningkatkan atau menurunkan laju transkripsi gen-gen seperti halnya gen-gen struktural pada operon lac. Mutagenesis promoter-promoter pada E. coli menunjukkan bahwa urutan basa yang menentukan fungsi promoter tersebut hanyalah suatu urutan yang sangat pendek.

Promoter s70 terdiri atas urutan basa sepanjang 40 hingga 60 pb. Daerah antara –55 dan +20 telah diketahui merupakan daerah pengikatan RNA polimerase, sedangkan daerah antara –20 dan +20 diketahui sangat terlindung dari aktivitas nuklease oleh DNase I. Hal ini menunjukkan bahwa daerah tersebut sangat berkaitan dengan polimerase yang menghalangi akses nuklease menuju DNA. Mutagenesis promoter memperlihatkan bahwa urutan hingga lebih kurang –40 mempunyai peranan yang penting bagi fungsi promoter. Selain itu, dua urutan sepanjang 6 pb pada posisi sekitar  –10 dan –35 terbukti sangat penting bagi fungsi promoter pada E. coli.

 Urutan –10

Urutan yang paling lestari (konservatif) pada promoter s70, atau sering dikatakan sebagai urutan konsensus, adalah urutan sepanjang 6 pb yang dijumpai pada promoter-promoter berbagai macam gen pada E. coli. Urutan ini terpusat di sekitar posisi –10 jika dilihat dari tapak inisiasi transkripsi dan dinamakan kotak Pribnow karena ditemukan oleh Pribnow pada tahun 1975. Urutan konsensus pada kotak Pribnow adalah TATAAT. Kedua basa pertama (TA) dan T yang terakhir merupakan basa-basa yang paling konservatif. Urutan heksamer ini dipisahkan sejauh 5 hingga 8 pb dari tapak inisiasi, dan urutan penyela yang memisahkan urutan -10 dengan tapak inisiasi tersebut tidaklah konservatif. Urutan –10 nampaknya merupakan urutan tempat terjadinya inisiasi pembukaan heliks oleh RNA polimerase.

 Urutan -35

Pada terlihat bahwa selain urutan -10, terdapat pula urutan heksamer lain yang konservatif, yaitu urutan di sekitar posisi -35, yang terdiri atas TTGACA. Urutan ini akan lebih konservatif lagi pada promoter-promoter yang efisien. Tiga basa pertama (TTG) merupakan posisi yang paling konservatif. Pada kebanyakan promoter urutan -35 dipisahkan sejauh 16 hingga 18 pb dari kotak Pribnow, dan urutan penyelanya bukanlah urutan yang penting.

Tapak inisiasi transkripsi

Pada 90% di antara semua gen, tapak inisiasi transkripsi (posisi +1) berupa basa purin, dan dalam hal ini G lebih umum dijumpai daripada A. Di samping itu, basa C dan basa T sering kali mengapit tapak inisiasi sehingga terdapat urutan CGT atau CAT

 

Efisiensi promoter

Urutan-urutan konsensus tersebut di atas khas dijumpai pada promoter-promoter yang kuat. Akan tetapi, di antara promoter yang berbeda sebenarnya terdapat variasi urutan yang cukup nyata, yang dapat mengakibatkan perbedaan efisiensi transkripsi hingga 1.000 kali. Secara garis besar, fungsi daerah-daerah pada promoter dapat dijelaskan sebagai berikut. Urutan -35 merupakan urutan pengenalan yang akan meningkatkan pengenalan dan interaksi dengan faktor s RNA polimerase, urutan -10 penting untuk inisiasi pembukaan heliks, dan urutan di sekitar tapak inisiasi mempengaruhi inisiasi transkripsi. Sementara itu, urutan 30 basa pertama yang akan ditranskripsi juga mempengaruhi transkripsi. Urutan ini mengatur laju pelepasan promoter dari RNA polimerase, yang memungkinkan reinisiasi transkripsi dapat dilakukan oleh kompleks polimerase lainnya. Pada akhirnya hal ini akan berpengaruh terhadap laju transkripsi dan kekuatan promoter.

Pentingnya pemisahan untai DNA pada reaksi inisiasi diperlihatkan oleh pengaruh superkoiling negatif DNA cetakan yang pada umumnya akan memacu laju transkripsi. Hal ini diduga karena struktur superkoil tersebut hanya memerlukan sedikit energi untuk membuka heliks. Beberapa urutan promoter tidak cukup mirip dengan urutan konsensus yang akan ditranskripsi dengan kuat pada kondisi normal. Sebagai contoh, promoter lac (Plac), yang memerlukan faktor aktivasi tambahan berupa protein reseptor cAMP atau cAMP protein receptor (CPR) untuk mengikat suatu tempat pada DNA yang letaknya berdekatan dengan urutan promoter tersebut agar pengikatan RNA polimerase dan inisiasi transkripsi dapat ditingkatkan. Sejumlah promoter lainnya, misalnya untuk gen-gen yang berhubungan dengan kejut panas, mempunyai urutan konsensus tertentu yang hanya dapat dikenali oleh RNA polimerase dengan faktor s selain s70.

Tahapan transkripsi pada prokariot

Berdasarkan gambar di atas, transkripsi pada prokariot berlangsung dalam tiga tahap, yaitu inisiasi, elongasi, dan teminasi.

Pengikatan promoter

Pada awalnya, RNA polimerase inti (a2bb’w) mempunyai afinitas nonspesifik terhadap DNA. Keadaan ini dikenal sebagai pengikatan longgar, dan sifatnya cukup stabil. Namun, begitu faktor s bergabung dengan enzim inti tersebut hingga terbentuk holoenzim, terjadilah pengurangan afinitas nonspesifik terhadap DNA hingga 20.000 kali. Sejalan dengan hal itu, faktor s juga meningkatkan pengikatan holoenzim pada tempat pengikatan promoter yang tepat hingga 100 kali. Dengan demikian, akan terjadi peningkatan spesifisitas holoenzim yang tajam dalam mengenali promoter. Pada genom E. coli holoenzim dapat mencari dan mengikat promoter dengan sangat cepat. Bahkan, karena begitu cepatnya, maka proses ini tidak mungkin terjadi melalui pengikatan dan pelepasan holoenzim dari DNA secara berulang-ulang. Kemungkinan yang masuk akal hanyalah melalui pergeseran holoenzim di sepanjang molekul DNA hingga mencapai urutan promoter. Pada promoter, holoenzim mengenali urutan -35 dan -10. Kompleks awal antara holoenzim dan promoter dikenal sebagai kompleks tertutup (closed complex).

 Pembukaan heliks

Agar pita antisens dapat diakses untuk perpasangan basa antara DNA dan RNA yang disintesis, untai ganda (heliks) DNA harus dibuka terlebih dahulu oleh enzim RNA polimerase. Pada kebanyakan gen pembukaan heliks oleh RNA polimerase akan dimudahkan oleh struktur superkoiling negatif DNA sehingga transkripsi dapat ditingkatkan. Namun, tidak semua promoter dapat diaktivasi oleh superkoiling negatif sehingga terisyaratkan bahwa perbedaan topologi DNA dapat mempengaruhi transkripsi. Hal ini mungkin karena adanya perbedaan hubungan sterik pada urutan -35 dan -10 di dalam heliks. Sebagai contoh, promoter untuk subunit enzim DNA girase justru dihambat oleh superkoiling negatif. Seperti kita ketahui, DNA girase adalah enzim yang bertanggung jawab untuk superkoiling negatif pada genom E. coli sehingga superkoiling negatif ini dapat bertindak sebagai umpan balik yang menghambat ekspresi DNA girase. Pembukaan awal heliks DNA akan menyebabkan pembentukan kompleks terbuka (open complex) dengan RNA polimerase. Proses ini dikenal sebagai pengikatan ketat.

Inisiasi

Berbeda dengan sintesis DNA, sintesis RNA dapat berlangsung tanpa adanya molekul primer. Oleh karena hampir semua tapak inisiasi transkripsi berupa basa G atau A, maka nukleosida trifosfat pertama yang digunakan untuk sintesis RNA adalah GTP atau ATP. Mula-mula RNA polimerase akan menggabungkan dua nukleotida pertama dan membentuk ikatan fosfodiester di antara kedua nukleotida tersebut. Selanjutnya, sembilan basa pertama ditambahkan tanpa disertai pergeseran RNA polimerase di sepanjang molekul DNA. Pada akhir penambahan masing-masing basa ini akan terdapat peluang yang nyata terjadinya aborsi untai RNA yang baru terbentuk itu. Proses inisiasi abortif mempengaruhi laju transkripsi secara keseluruhan karena proses tersebut memegang peranan utama dalam menentukan waktu yang dibutuhkan oleh RNA polimerase untuk meninggalkan promoter dan memungkinkan RNA polimerase lainnya menginisiasi putaran transkripsi berikutnya. Waktu minimum untuk pengosongan promoter ini adalah 1 hingga 2 detik, suatu waktu yang relatif lama bila dibandingkan dengan waktu untuk tahap-tahap transkripsi lainnya.

Elongasi

Jika inisiasi berhasil, RNA polimerase melepaskan faktor s, dan bersama-sama dengan DNA dan RNA nasen (RNA yang baru disintesis), akan membentuk kompleks terner atau kompleks yang terdiri atas tiga komponen. Dengan adanya kompleks terner ini RNA polimerase dapat berjalan di sepanjang molekul DNA. Artinya, promoter akan ditinggalkannya untuk kemudian ditempati oleh holoenzim RNA polimerase berikutnya sehingga terjadi reinisiasi transkripsi. Bagian DNA yang mengalami pembukaan heliks, atau disebut dengan gelembung transkripsi (transcription bubble), akan terlihat bergeser di sepanjang molekul DNA sejalan dengan gerakan RNA polimerase. Panjang bagian DNA yang mengalami pembukaan heliks tersebut relatif konstan, yakni sekitar 17 pb sedangkan ujung 5’ molekul RNA yang disintesis akan membentuk heliks hibrid dengan pita antisens DNA sepanjang lebih kurang 12 pb. Ukuran ini ternyata tidak mencapai satu putaran heliks.

RNA polimerase E. coli bergerak dengan kecepatan rata-rata 40 nukleotida per detik. Akan tetapi, angka ini dapat bervariasi sesuai dengan urutan lokal DNA (urutan DNA yang telah dicapai oleh RNA polimerase). Tetap dipertahankannya bagian DNA yang mengalami pembukaan heliks menunjukkan bahwa RNA polimerase membuka heliks DNA di depan gelembung transkripsi dan menutup heliks DNA di belakangnya. Dengan demikian, heliks hibrid RNA-DNA harus berputar setiap kali terjadi penambahan nukleotida pada RNA nasen.

 

Terminasi

RNA polimerase tetap terikat pada DNA dan melangsungkan transkripsi hingga mencapai urutan terminator (sinyal stop), yang pada umumnya berupa struktur seperti tusuk konde (hairpin). Struktur yang terdiri atas batang dan lengkung (loop) ini terjadi karena RNA hasil transkripsi mengalami komplementasi diri. Biasanya, bagian batang sangat kaya dengan GC sehingga sangat stabil (GC mempunyai ikatan rangkap tiga). Di sebelah downstream (3’) dari struktur tusuk kode sering kali terdapat urutan yang terdiri atas empat U atau lebih. RNA polimerase akan segera berhenti begitu struktur tusuk konde RNA disintesis. Bagian ujung RNA yang mengandung banyak U tersebut mempunyai ikatan yang lemah dengan basa-basa A pada DNA cetakan sehingga molekul RNA hasil sintesis akan dengan mudah terlepas dari kompleks transkripsi. Selanjutnya, pita DNA cetakan yang sudah tidak berikatan atau membentuk hibrid dengan RNA segera menempel kembali pada pita DNA komplemennya. RNA polimerase inti pun akhirnya terlepas dari DNA.

Terminasi menggunakan protein rho

selain karena adanya struktur tusuk konde, terminasi transkripsi dapat juga terjadi dengan bantuan suatu protein khusus yang dinamakan protein rho (ρ). Rho merupakan protein heksamer yang akan menghidrolisis ATP dengan adanya RNA untai tunggal. Protein ini nampak terikat pada urutan sepanjang 72 basa pada RNA, yang diduga lebih disebabkan oleh pengenalan suatu struktur spesifik daripada karena adanya urutan konsensus. Rho bergerak di sepanjang RNA nasen menuju kompleks transkripsi. Pada kompleks transkripsi ini rho memungkinkan RNA polimerase untuk berhenti pada sinyal terminator tertentu. Sinyal-sinyal terminator ini, seperti halnya sinyal terminator yang tidak bergantung kepada rho, lebih dikenali oleh RNA daripada oleh DNA cetakannya. Adakalanya terminator tersebut juga berupa struktur tusuk konde tetapi tidak dikuti oleh urutan poli U.

Tulisan ini disusun oleh Sarah Samben dari berbagai sumber



 
4 Komentar

Ditulis oleh pada 28 April 2011 in Biomolekuler

 

Tag: , , , , , ,

4 responses to “Transkripsi pada Prokaryotik

  1. NURFATHURRAHMAH

    29 April 2011 at 2:07 AM

    mkch k….semoga allah membalas kbaikan k….

     
  2. Nadjeeb

    29 November 2011 at 9:51 PM

    Nice Post Sarah….

     
  3. GustiAgung Angga

    27 November 2016 at 11:58 PM

    nice post, mbak boleh share sumbernya gak?

     

Tinggalkan Balasan

Isikan data di bawah atau klik salah satu ikon untuk log in:

Logo WordPress.com

You are commenting using your WordPress.com account. Logout / Ubah )

Gambar Twitter

You are commenting using your Twitter account. Logout / Ubah )

Foto Facebook

You are commenting using your Facebook account. Logout / Ubah )

Foto Google+

You are commenting using your Google+ account. Logout / Ubah )

Connecting to %s

 
%d blogger menyukai ini: