RSS

Arsip Kategori: Biomolekuler

Gen Makhluk Hidup dapat Diubahkah???


Gen merupakan satuan biologis yang membawa sifat keturunan. Gen mempunyai tiga sifat dasar (1) gen mempunyai fungsi spesifik dalam sel dan organisme seutuhnya, (2) gen harus mampu menggandakan dirinya secara tepat sehingga spesifitas fungsinya selalu dipertahankan dari satu generasi ke generasi, (3) dalam keadaan normal, gen merupakan molekul yang stabil, namun dalam menghadapi perubahan lingkungan, gen dapat bersifat sensitif atau rentan sehingga dapat menimbulkan mutasi pada urutan basa nukleotidanya (Fatchiyah, biologi molekuler).
Berarti gen bersifat sensitif ini dapat diatur sedemikian rupa oleh manusia itu sendiri. Jika manusia selalu berpikir positif, maka gen dalam tubuhnya berekspresi positif dan menunjukkan kelakuan yang positif. Begitupun, jika manusia berpikir selalu hidup dalam kesuksesan, otomatis gen-gen dalam tubuhnya akan terekspresi sedemikian rupa menimbulkan jiwa yang rajin, ulet dalam bekerja.
Menurut Trina Tallei dalam tulisan diblognya (Mengubah Takdir Genetik) Gen merupakan penentu utama kesehatan kita, sehingga DNA apa pun yang diwariskan kepada kita, kita tidak dapat mengubahnya. Kenyataannya, penelitian mengenai epigenetik kontradiksi dengan premis ini. Dasar epigenetik adalah walaupun kita mewarisi serangkaian DNA yang tidak dapat diubah urutannya, kita memiliki kemampuan untuk mengaktifkan atau membungkan ekspresi gen sebagai akibat dari pengalaman hidup kita. Artinya, totalitas pengalaman hidup kita, apa yang kita pikirkan, rasakan, dan yakini, mengenai diri kita sendiri, apa yang kita makan, juga faktor-faktor eksternal lain, memberikan kontribusi yang besar terhadap ekspresi gen kita. Sekarang ini, kita bisa membayangkan bahwa kita bisa “bermain-main” dengan ekspresi gen kita, sekehendak kita, mau mengekspresikan hal-hal yang baik atau buruk, tergantung kita.

 
Tinggalkan komentar

Ditulis oleh pada 1 Oktober 2014 in Biomolekuler, Uncategorized

 

Tag: ,

Semangka dan Tomat Partenokarpi


Partenokarpi merupakan mekanisme pembentukan buah tanpa melalui proses polinasi dan fertilisasi. partenokarpi dapat dilakukan dengan cara persilangan antara buah tetraploid dan buah diploid yang menghasilkan buah triploid. percobaan ini diujicobakan pada buah semangka.

Teknik pembentukan semangka tetraploid menurut Ihsan (2008) yaitu

  1. Menyiapkan bahan seperti biji semangka, kolkhisin, akuades steril, IAA, DMSO, alkohol 70%, dan kertas tisu. Alatnya erlenmenyer, batang pengaduk, dan pipet mikro.
  2. Biji semangka yang akan digunakan adalah biji yang sehat dan bernas. Mencuci biji dengan akuades steril dan memasukkannya ke dalam tabung erlemenyer.
  3. Merendam biji pada tingkat konsentrasi 0,5% dengan lama perendaman 35 jam.
  4. Sebelumnya, kolkhisin diencerkan dengan menggunakan alkohol 70%. Dengan cara menimbang 100 mg kolkhisin, kemudian dilarutkan dengan 100 ml alkohol 70% dalam tabung erlemenyer. IAA ditimbang 100 mg kemudian dilarutkan dalam 100 ml akuades steril dalam tabung erlemenyer. Larutan DMSO juga dilarutkan dengan akuades steril. Cara pelarutan DMSO diambil 0,1 ml dengan menggunakan pipet mikro kemudian dilarutkan dalam 100 ml akuades steril dalam tabung erlemenyer.Untuk membuat 100 ml larutan perendaman pada tingkat konsentrasi kolkisin dilakukan dengan cara Kolkhisin 0,5% yaitu 0,5 ml larutan stok kolkhisin + 0,1 ml larutan stok IAA + 2 ml larutan stok DMSO dilarutkan dalam 100 ml akuades steril.
  5. Menuang larutan perendam ke dalam tabung erlemenyer berisi biji semangka.
  6. Mengeluarkan biji yang telah direndam lalu meletakkannya di atas tisu setengah basah kemudian ditutup dengan tisu basah. Tisu diusahakan tidak terlalu basah agar biji tidak busuk. Mengecambahkan biji maksimal 2 hari dalam kotak inkubator dengan suhu 30-35⁰C dan kelembapan 80-85%.
  7. Setelah 2 hari pengecambahan, menanam biji yang telah tumbuh akarnya dalam polybag 10×15 dengan media tanah, pasir, dan pupuk kandang dengan perbandingan 1:1:1.
  8. Menanam biji semangka di lapangan pada umur 24 hari setelah pengecambahan.
  9. Menanam bibit satu semaian per lubang tanam. Pemupukan dengan 450 Kg N, 375 P2O5 kg K2O/ha dilakukan 5-7 kali.

Untuk tomat partenokarpi dapat dilakukan dengan rekayasa genetika. Rekayasa genetik buah tanpa biji dilakukan dengan cara menyisipkan gen partenokarpi ke dalam kromosom tanaman target. Salah satu contoh gen partenokarpi adalah DefH9-iaaM. Gen ini dihasilkan oleh Dr. Rotino dan kawan-kawan dari Pusat Penelitian
Sayuran di Montanazo, Milan-Italia. Gen ini diisolasi dari bakteri Pseudomonas dan dapat mengekspresikan senyawa prekursor IAA (auksin) pada awal pembungaan di bagian bakal biji (ovul) dan plasenta. Senyawa ini dapat menggantikan peran biji pada proses pembentukan buah, sehingga tanaman dapat menghasilkan buah tanpa biji (Pardal, 2009).

 
Tinggalkan komentar

Ditulis oleh pada 26 Mei 2011 in Biomolekuler

 

Tag: ,

Mutasi


Mutasi berasal dari kata Mutatus (bahasa latin) yang artinya adalah perubahan. mutasi didefenisikan sebagai perubahan materi genetic (DNA) yang dapat diwariskan secara genetis keketurunannya.

             Istilah mutasi petama kali digunakan oleh Hugo de Vries, untuk mengemukakan adanya perubahan fenotipe yang mendadak  pada bunga Oenothera lamarckiana  dan bersifat menurun. Ternyata perubahan tersebut terjadi karena adanya penyimpangan dari kromosomnya. Seth wright juga melaporkan peristiwa mutasi pada domba jenis Ancon yang berkaki pendek dan bersifat menurun. Penelitian ilmiah tentang mutasi dilakukan pula oleh Morgan (1910) dengan menggunakan Drosophila melanogaster (lalat buah). Akhirnya murid Morgan yang bernama Herman Yoseph Muller berhasil dalam percobaannya terhadap lalat buah, yaitu menemukan mutasi buatan dengan menggunakan sinar X (Anonim, 2009).

Mutasi adalah perubahan pada materi genetik suatu makhluk yang terjadi secara tiba-tiba, acak, dan merupakan dasar bagi sumber variasi organisme hidup yang bersifat terwariskan (heritable). Mutasi juga dapat diartikan sebagai perubahan struktural atau komposisi genom suatu jasad yang dapat terjadi karena faktor luar (mutagen) atau karena kesalahan replikasi. Peristiwa terjadinya mutasi disebut mutagenesis. Makhluk hidup yang mengalami mutasi disebut mutan dan factor penyebab mutasi disebut mutagen (mutagenic agent). Perubahan urutan nukleotida yang menyebabkan protein yang dihasilkan tidak dapat berfungsi baik dalam sel dan sel tidak mampu mentolerir inaktifnya protein tersebut, maka akan menyebabkan kematian (lethal mutation).

             Mutasi dapat mempengaruhi DNA maupun kromosom. DNA dapat dipengaruhi pada saat sintesis DNA (replikasi). Pada saat tersebut factor mutagenic mempengarugi pasangan basa nukleutida sehingga tidak berpasangan dengan basa nukleutida yang seharusnya (mismatch). Misalnya triplet DNA cetakan adalah TTA. Namun karena adanya mutagen menyebabkan DNA polymerase memasangkan A dengan C, bukan dengan T . Untuk lebih jelasnya mekanisme mutasi dapat dilihat pada gambar di bawah ini:

A.    Jenis-jenis Mutasi

  1. Menurut Kejadiannya

Mutasi dapat terjadi secara spontan (spontaneous mutation) dan juga dapat terjadi melalui induksi (induced mutation). Mutasi spontan adalah mutasi (perubahan materi genetik) yang terjadi akibat adanya sesuatu pengaruh yang tidak jelas, baik dari lingkungan luar maupun dari internal organisme itu sendiri. Sedangkan mutasi terinduksi adalah mutasi yang terjadi akibat paparan dari sesuatu yang jelas, misalnya paparan sinar UV. Secara mendasar tidak terdapat perbedaan antara mutasi yang terjadi secara alami dan mutasi hasil induksi.

 2.Berdasarkan Sel yang Bermutasi

Berdasarkan jenis sel yang mengalami mutasi, mutasi dibedakan atas mutasi somatik dan mutasi gametik atau germinal. Mutasi somatik adalah mutasi yang terjadi pada sel-sel somatik. Sedangkan mutasi gametik atau germinal adalah mutasi yang terjadi pada sel gamet. Mutasi somatik dapat diturunkan dan dapat pula tidak diturunkan. Sedangkan mutasi gametik, karena terjadinya di sel gamet, maka akan diwariskan oleh keturunannya.

3.Berdasarkan Bagian yang Bermutasi

Berdasarkan bagian yang bermutasi, mutasi dibedakan menjadi mutasi DNA, mutasi gen dan mutasi kromosom.

a.      Mutasi DNA

1. Mutasi DNA terdiri atas:Mutasi transisi, yaitu suatu pergantian basa purin dengan basa purin lain atau pergantian basa pirimidin dengan basa pirimidin lain; atau disebut juga pergantian suatu pasangan basa purin-pirimidin dengan pasangan purin-pirimidin lain. Misalnya: ATàGS, GSàAT, SGàTA. Seperti pada gambar di bawah ini

2. Mutasi tranversi, yaitu suatu pergantian antara purin dengan pirimidin pada posisi yang sama. Seperti tampak pada gambar di bawah ini

3. Insersi, yaitu penambahan satu atau lebih pasangan nukleotida pada suatu gen. seperti tampak pada gambar di bawah ini:

4. Delesi, yaitu pengurangan satu atau lebih pasangan nukleotida pada suatu gen. seperti tampak pada gambar di bawah ini:

 b. Mutasi Gen

            Mutasi gen merupakan perubahan yang terjadi pada nukleutida  DNA yang membawa “pesan” suatu gen tertentu. Mutasi gen pada dasarnya merupakan mutasi titik. Mutasi titik (point mutation) merupakan perubahan kimiawi pada satu atau beberapa pasangan basa dalam satu gen tunggal.

Mutasi gen adalah mutasi yang terjadi dalam lingkup gen. Peristiwa yang terjadi pada mutasi gen adalah perubahan urutan-urutan DNA. Jenis-jenis mutasi gen adalah sebagai berikut:

Mutasi salah arti (missens mutation), yaitu perubahan suatu kode genetic (umumnya pada posisi 1 dan 2 pada kodon) sehingga menyebabkan asam amino terkait (pada polipeptida) berubah. Perubahan pada asam amino dapat menghasilkan fenotip mutan apabila asam amino yang berubah merupakan asam amino esensial bagi protein tersebut. Jenis mutasi ini dapat disebabkan oleh peristiwa transisi dan tranversi.

Mutasi diam (silent mutation), yaitu perubahan suatu pasangan basa dalam gen (pada posisi 3 kodon) yang menimbulkan perubahan satu kode genetik tetapi tidak mengakibatkan perubahan atau pergantian asam amino yang dikode. Mutasi diam biasanya disebabkan karena terjadinya mutasi transisi dan tranversi.

Mutasi tanpa arti (nonsense mutation), yaitu perubahan kodon asam amino tertentu menjadi kodon stop. Hampir semua mutasi tanpa arti mengarah pada inaktifnya suatu protein sehingga menghasilkan fenotip mutan. Mutasi ini dapat terjadi baik oleh tranversi, transisi, delesi, maupun insersi.

Mutasi perubahan rangka baca (frameshift mutation), yaitu mutasi yang terjadi karena delesi atau insersi satu atau lebih pasang basa dalam satu gen sehingga ribosom membaca kodon tidak lengkap. Akibatnya akan menghasilkan fenotip mutan.

  1. Mutasi kromosom

Mutasi kromosom yaitu mutasi yang disebabkan karena perubahan struktur kromosom atau perubahan jumlah kromosom. Istilah mutasi pada umumnya digunakan untuk perubahan gen, sedangkan perubahan kromosom yang dapat diamati dikenal sebagai variasi kromosom atau mutasi besar/ gross mutation atau aberasi. Mutasi kromosom sering terjadi karena kesalahan pada meiosis maupun pada mitosis. Pada prinsipnya, mutasi kromosom digolongkan rnenjadi dua, yaitu sebagai berikut.

  1. Mutasi Komosom Akibat Perubahan Jumlah Kromosom

Mutasi kromosom yang terjadi karena perubahan jumlah kromosom (ploid) melibatkan kehilangan atau penambahan perangkat kromosom (genom) disebut euploid, sedang yang hanva terjadi pada salah satu kromosom dari genorn disebut aneuploid.

  1. Euploid (eu = benar; ploid = unit) Yaitu jenis mutasi dimana terjadi perubahan pada jumlah n. Makhluk hidup yang terjadi dari perkembangbiakan secara kawin, pada umumnya bersifat diploid, memiliki 2 perangkat kromosom atau 2 genom pada sel somatisnya (2n kromosom). Organismee yang kehilangan I set kromosomnya sehingga memiliki satu genom atau satu perangkat kromosom (n kromosom) dalam sel somatisnya disebut monoploid. Sedang organisme yang memiliki lebih dari dua genom disebut poliploid. Mutasi poliploid ada dua, yaitu (1) autopoliploid yang terjadi akibat n-nya mengganda sendiri karena kesalahan meiosis dan terjadi pada krornosom homolog, misalnya semangka tak berbiji; dan (2) alopoIiploid yang terjadi karena perkawinan atau hybrid antara spesies yang berbeda jumlah set kromosomnya dan terjadi pada kromosom non homolog, misalnya Rhaphanobrassica (akar seperti kol, daun mirip lobak).
  2. Aneuploid (an = tidak; eu = benar; Ploid = Unit)  Yaitu jenis mutasi dimana terjadi perubahan jumlah kromosom. Mutasi kromosom ini tidak melibatkan seluruh genom yang berubah, rnelainkan hanya terjadi pada salah satu kromosom dari genom. Mutasi ini disebut juga dengan istilah aneusomik. Penyebab mutasi ini adalah anafase lag (peristiwa tidak melekatnya benang-benang spindle ke sentromer) dan nondisjunction (gagal berpisal). Macam-macam aneusomik antara lain sebagai berikut.
  • monosomik (2n-1); yaitu mutasi karena kekurangan satu kromosom, misalnya Sindrom Turner pada manusia dimana jumlah kromosomnya 45 dan kehilangan 1 kromosom kelamin (22AA+X0).
  • nullisomik (2n-2); yaitu mutasi karena kekurangan dua kromosom
  • trisomik (2n + 1); yaitu mutasi karena kelebihan satu kromosom, misalnya Sindrom Klinefelter pada manusia dengan kariotipe 22AA+XXY dan Sindrom Jacobs (22AA+XYY).
  • tetrasomik (2n * 2); yaitu mutasi karena kelebihan dua kromosom.

2.  Mutasi Kromosom Akibat Perubahan Struktur Kromosom

Mutasi karena perubahan struktur kromosom atau kerusakan bentuk kromosom disebut juga dengan istilah aberasi. Macam-macam aberasi dapat dijelaskan sebagai berikut.

  1.  Delesi atau defisiensi

Delesi adalah mutasi karena kekurangan segmen kromosom. Penghilangan dapat terjadi pada segmen panjang lengan kromosom seperti yang dilaporkan pada tanaman gandum. Tergantung pada gen dan tingkat ploidi, defisiensi dapat menyebabkan kematian, separuh kematian, atau menurunkan viabilitas. Pada tanaman defisiensi yang ditimbulkan oleh perlakuan bahan mutagen (radiasi) sering ditunjukkan dengan munculnya mutasi klorofil. Kejadian mutasi klorofil biasanya dapat diamati pada stadia muda (seedling stag), yaitu dengan adanya perubahan warna pada daun tanaman. Macam-macam delesi antara lain:

  • Delesi terminal; ialah delesi yang kehilangan ujung segmen kromosom.
  • Delesi intertitial; ialah delesi yang kehilangan bagian tengah kromosom
  • Delesi cincin; ialah delesi yang kehilangan segmen kromosom sehingga berbentuk lingkaran seperti cincin.
  • Delesi loop; ialah delesi cincin yang membentuk lengkungan pada kromosom lainnya.
  1. Duplikasi

Mutasi karena kelebihan segmen kromosom. Mutasi ini terjadi pada waktu meiosis, sehingga memungkinkan adanya kromosom lain (homolognya) yang tetap normal. Duplikasi menampilkan cara peningkatan jumlah gen pada kondisi diploid. Dulikasi dapat terjadi melalui beberapa cara seperti: pematahan kromosom yang kemudian diikuti dengan transposisi segmen yang patah, penyimpangan dari mekanisme crossing-over pada meiosis (fase pembelahan sel), rekombinasi kromosom saat terjadi translokasi, sebagai konsekuensi dari inversi heterosigot, dan sebagai konsekuensi dari perlakuan bahan mutagen. Beberapa kejadian duplikasi telah dilaporkan dapat miningkatkan viabilitas tanaman. Pengaruh radiasi terhadap duplikasi kromosom telah banyak dipelajari pada bermacam jenis tanaman seperti jagung, kapas, dan barley.

  1. Translokasi.

Translokasi ialah mutasi yang mengalami pertukaran segmen kromosom ke kromosom non homolog. Macam-macam translokasi antara lain sebagai berikut.

l.   Translokasi homozigot (resiprok)

Translokasi homo zigot ialah translokasi yang mengalami pertukaran segmen kedua kromosom homolog dengan segmen kedua kromosom non homolog.

2.  Translokasi heterozigot (non resiprok)

Translokasi heterozigot ialah translokasi yang hanya mengalami pertukaran satu segmen kromosom ke satu segmen kromosom nonhomolog.

3.  Translokasi Robertson

Translokasi Robertson ialah translokasi yang terjadi karena penggabungan dua kromosom akrosentrik menjadi satu kromosom metasentrik, maka disebut juga fusion (penggabungan). Translokasi terjadi apabila dua benang kromosom patah setelah terkena energi radiasi, kemudian patahan benang kromosom bergabung kembali dengan cara baru. Patahan kromosom yang satu berpindah atau bertukar pada kromosom yang lain sehingga terbentuk kromosom baru yang berbeda dengan kromosom aslinya. Translokasi dapat terjadi baik di dalam satu kromosom (intrachromosome) maupun antar kromosom (interchromosome). Translokasi sering mengarah pada ketidakseimbangan gamet sehingga dapat menyebabkan kemandulan (sterility) karena terbentuknya chromatids dengan duplikasi dan penghapusan. Alhasil, pemasangan dan pemisahan gamet jadi tidak teratur sehingga kondisi ini menyebabkan terbentuknya tanaman aneuploidi. Translokasi dilaporkan telah terjadi pada tanaman Aegilops umbellulata dan Triticum aestivum yang menghasilkan mutan tanaman tahan penyakit.

 4) Inversi

Inversi ialah mutasi yang mengalami perubahan letak gen-gen, karena selama meiosis kromosom terpilin dan terjadi kiasma. Inversi terjadi karena kromosom patah dua kali secara simultan setelah terkena energi radiasi dan segmen yang patah tersebut berotasi 180o dan menyatu kembali. Kejadian bila centromere berada pada bagian kromosom yang terinversi disebut pericentric, sedangkan bila centromere berada di luar kromosom yang terinversi disebut paracentric. Inversi pericentric berhubungan dengan duplikasi atau penghapusan chromatid yang dapat menyebabkan aborsi gamet atau pengurangan frequensi rekombinasi gamet. Perubahan ini akan ditandai dengan adanya aborsi tepung sari atau biji tanaman, seperti dilaporkan terjadi pada tanaman jagung dan barley. Inversi dapat terjadi secara spontan atau diinduksi dengan bahan mutagen, dan dilaporkan bahwa sterilitas biji tanaman heterosigot dijumpai lebih rendah pada kejadian inversi daripada translokasi. Macam-macam inversi antara lain sebagai berikut.

a) Inversi parasentrik; teriadi pada kromosom yang tidak bersentromer.

b) lnversi perisentrik; terjadi pada kromosom yang bersentromer.

5) Isokromosom

lsokromosom ialah mutasi kromosom yang terjadi pada waktu menduplikasikan diri, pembelahan sentromernya mengalami perubahan arah pembelahan sehingga terbentuklah dua kromosom yang masing – masing berlengan identik (sama). Dilihat dari pembelahan sentromer maka isokromosom disebut juga fision, jadi peristiwanya berlawanan dengan translokasi Robertson (fusion) yang mengalami penggabungan.

 6) Katenasi

Katenasi ialah mutasi kromosom yang terjadi pada dua kromosom non homolog yang pada waktu membelah menjadi empat kromosom, salinq bertemu ujung-ujungnya sehingga membentuk lingkaran.

B.     Penyebab Mutasi (Mutagen)

Penyebab mutasi dalam lingkungan dapat bersifat fisik, kimia, dan biologis.

  1. Mutagen Fisik

Penyebab mutasi dalam lingkungan yang bersifat fisik adalah radiasi dan suhu. Radiasi sebagai penyebab mutasi dibedakan menjadi radiasi pengion dan radiasi bukan pengion. Radiasi pengion adalah radiasi berenergi tinggi sedangkan radiasi bukan pengion adalah radiasi berenergi rendah. Contoh radiasi pengion adalah radiasi sinar X, sinar gamma, radiasi sinar kosmik. Contoh radiasi bukan pengion adalah radiasi sinar UV. Radiasi pengion mampu menembus jaringan atau tubuh makhluk hidup karena berenergi tinggi. Sementara radiasi bukan pengion hanya dapat menembus lapisan sel-sel permukaan karena berenergi rendah. Radiasi sinar tersebut akan menyebabkan perpindahan elektron-elektron ke tingkat energi yang lebih tinggi. Ataom-ataom yang memiliki elektron-elektron sedemikian dinyatakan tereksitasi atau tergiatkan. Molekul-molekul yang mengandung atom yang berada dalam keadaan tereksitasi maupun terionisasi secara kimiawi lebih reaktif daripada molekul yang memiliki atom-atom yang berada dalam kondisi stabil. Raktivitas yang meningkat tersebut mengundang terjadinya sejumlah reaksi kimia, terutama mutasi. Radiasi pengion dapat menyebabkan terjadinya mutasi gen dan pemutusan kromosom yang berakibat delesi, duplikasi, insersi, translokasi serta fragmentasi kromosom umumnya.

 2. Mutagen Kimiawi

Penyebab mutasi dalam lingkungan yang bersifat kimiawi disebut juga mutagen kimiawi. Mutagen-mutagen kimiawi tersebut dapat dipilah menjadi 3 kelompok, yaitu analog basa, agen pengubah basa dan agen penyela. Senyawa yang merupakan contoh analog basa adalah 5-Bromourasil (5 BU). 5-BU adalah analog timin. Dalam hubungan ini posisi karbon ke-5 ditempati oleh gugus brom padahal posisi itu sebelumnya ditempati oleh gugus metil. Keberadaan gugus brom mengubah distribusi muatan serta meningkatkan peluang terjadinya tautomerik. Senyawa yang tergolong agen pengubah basa adalah mutagen yang secara langsung mengubah struktur maupun sifat kimia dari basa, yang termasuk kelompok ini adalah agen deaminasi, agen hidroksilasi serta agen alkilasi. Perlakuan dengan asam nitrit, misalnya, terhadap sitosin akan menghasilkan urasil yang berpasangan dengan adenin sehingga terjadi mutasi dari pasangan basa S-G menjadi T-A. Agen hidroksilasi adalah mutagen hydroxammin yang bereaksi khusus dengan sitosin dan menguabhnya sehingga sitosisn hanya dapat berpasangan dengan adenin. Sebagai akibatnya terjadi mutasi dari SG menjadi TA.agen alkilasi mengintroduksi gugus alkil ke dalam basa pada sejumlah posisi sehingga menyebabkan perubahan basa yang akibatnya akan terbentuk pasangan basa yang tidak lazim. Senyawa yang tergolong agen interkalasi akan melakukan insersi antara basa-basa yang berdekatan pada sati atau kedua unting DNA. Contoh agen interkalasi adalah proflavin, aeridine, ethidium bromide, dioxin dan ICR-70.

 
4 Komentar

Ditulis oleh pada 12 Mei 2011 in Biomolekuler

 

Tag: , , , , , , , , ,

Replikasi Pada Eukariotik


  1. Model-Model Replikasi

Replikasi atau perbanyakan asam nukleat dilakukan dengan dua cara yaitu replikasi dan transkripsi. Kedua proses tersebut digunakan satu utasan asam nukleat sebagai modelnya.Dalam proses replikasi perbanyakan satu molekul asam nukleat dilakukan dengan menggunakan dirinya sebagai model cetakan. Menurut pada ahli, ada tiga model replikasi DNA yaitu :

  1. Model konservatif, Double helix parental tetap utuh, disampingnya dicetak molekul DNA baru
  2. Model semikonservatif, Dua pita spiral dari double helix memisahkan diri, tiap pita tunggal dari double helix parental ini berlaku sebagai cetakan (template) untuk membentuk pita   pasangan yang baru.
  3. Model dispersif, Kedua pita dari double helix parental putus dibeberapa tempat kemudian dibentuk segmen-segmen DNA baru Selanjutnya potongan-potongan DNA parental dan DNA baru bersambungan dan menghasilkan dua double helix baru.

Gambar 1 : Tiga model replikasi

Pada tahun 1958 Matthew Meselson dan Franklin Stahl berhasil menunjukkan secara empiris bahwa replikasi DNA berlangsung dengan mekanisme secara semikonservatif. Meselson dan Stahl melakukan eksperimen untuk mengetahui mekanisme replikasi DNA dengan menggunakan bakteri Escherichia coli. Pertama kali, bakteri E.coli ditumbuhkan dalam medium yang mengandung nitrogen “berat” yaitu isotop 15N selama beberapa generasi. Dengan cara demikian maka molekul DNA induk mempunyai label berupa isotop berat sehingga molekulnya mempunyai densitas yang lebih tinggi dibanding DNA normal. Sel-sel yang molekul DNA-nya sudah berlabel tersebut kemudian dipindahkan ke medium baru yang mengandung isotop nitrogen yang “ringan“, yaitu 14N. Pada selang waktu tertentu setelah dipindahkan ke medium baru, sampel sel dipanen dan DNA-nya diisolasi. DNA hasil isolat tersebut kemudian disentrifugasi dengan ultrasentrifugasi gradien CsCl untuk menentukan densitas molekul DNA-nya. Hasil pengukuran densitas DNA yang diisolasi pada generasi pertama, semua DNA mempunyai densitas molekul hibrid, yaitu densitas yang dihasilkan oleh gabungan molekul DNA yang mengandung 15N dan 14N. Sebelum dipindahkan ke medium yang mengandung 14N ( yaitu generasi ke 0), kedua untaian DNA induk mengandung isotop 15N. Pada generasi kedua, densitas molekul DNA terdiri atas dua kelompok yaitu yang mempunyai densitas molekul hibrid dan yang mempunyai densitas lebih rendah dibanding dengan densitas molekul hibrid. Kelompok kedua tersebut terdiri atas molekul DNA yang kedua untaiannya mengandung isotop 14N.

Hasil eksperimen Meselson dan Stahl tersebut menunjukkan bahwa molekul DNA anakan terdiri atas satu untai DNA induk dan satu untai DNA hasil sintesis baru sehingga sesuai dengan model replikasi secara semikonservatif. Hasil eksperimen tersebut kemudian dikonfirmasi lagi dengan eksperimen kedua. Dalam eksperimen ini, molekul DNA hibrid didenaturasi dengan pemanasan pada suhu 1000C, kemudian disentrifugasi dalam gradien CsCl. DNA yang sudah didenaturasi tersebut menghasilkan dua pita DNA yang terdiri atas untai tunggal DNA yang mengandung 15N dan untai-tunggal DNA yang mengandung 14N. Berdasarkan atas eksperimen dapat disimpulkan bahwa replikasi DNA berlangsung secara semikonservatif.

Gambar 2: Semi konservatif (Masselson-Stahl)1958

Gambar 3: Percobaan Matthew Meselson dan Franklin

  1. Komponen-Komponen penting Dalam replikasi. Replikasi bahan genetik ditentukan oleh beberapa komopen utama yaitu :DNA cetakan, yaitu molekul DNA atau RNA yang akan direplikasi. Molekul deoksiribonukleotida, yaitu dATP, dTTP, dCTP, dan dGTP.Deoksiribonukleotida terdiri atas tiga komponen yaitu:
    1. Basa purin atau pirimidin
    2. Gula 5- karbon (deoksiribosa)
    3. Gugus fosfat
    4. Enzim DNA polimerase, yaitu enzim utama yang mengkatalisis proses polimerase nukleotida menjadi untaian DNA. Pada eukariotik terdapat lima macam DNA polimerase yaitu DNA polimerase α, DNA polimerase δ, DNA polimerase ε, DNA polimerase β , dan DNA polimerase γ.
    5. Enzim primase yaitu, enzim yang mengkatalisis sintesis primer untuk memulai replikasi DNA.
    6. Enzim pembuka ikatan untaian DNA induk, yaitu enzim helikase dan enzim lain yang membantu proses tersebut yaitu enzim girase
    7. Molekul protein yang menstabilkan untaian DNA yang sudah terbuka, yaitu protein SSB (single strand binding protein)
    8. Enzim DNA ligase, yaitu suatu enzim yang berfungsi untuk meyambung fragmen-fragmen DNA
    9. Syarat-Syarat Terjadinya Replikasi
    10. Titik awal replikasi

Proses replikasi selalu dimulai pada wilayah tertentu yaitu titik awal replikasi (ori). Molekul DNA yang dapat bereplikasi atau mengandung titik ori disebut replikon , kromosom E.coli : Satu titik ori (Ori C), Plasmid F : dua titik ori (Ori V, ori T), Kromosom Eukariot : Lebih dari satu titik ori, Kromosom mitokondria : dua titik ori.

1. Utas ganda (double helix)

Untuk berlangsungnya proses replikasi diperlukan adanya asam nukleat berutas ganda (double helix). Adanya dua utas polinukleotida serta perpasangan antiparalel antara basa-basanya, memungkinkan satu utasan dari DNA tersebut menjadi model untuk utasan yang lainnya.

2. Sintesis DNA mempunyai arah pertumbuhan 5 ke 3

Proses sintesis DNA dua nukleotida digabungkan satu dengan lain dengan cara merangkaikan karbon gula kelima (C5) yang mengandung fosfat dari satu nukleotida kepada karbon gula ketiga (C3) yang mengandung OH dari nukleotida lain.

3. Replikasi berjalan secara bertahap

Proses replikasi berlangsung dua kejadian:

  1. Penguraian helix ganda menjadi utasan tunggal
  2. Sintesis rantai baru dengan menggunakan utasan tunggal tersebut sebagai model yang sekaligus menjadikan helix ganda yang utuh.

Pada percabangan replikasi terdapat 2 cabang yang berbeda ujungnya yaitu :

Ujung 3 OH (cabang “Leading”)

Arah sintesis berjalan dari ujung menuju pangkal percabangan, maka sintesis berjalan secara kontinu sejalan dengan proses penguraian pilinan heliks ganda. Pada replikasi DNA, untaian pengawal (leading strand) ialah untaian DNA yang disintesis dengan arah 5’→3′ secara berkesinambungan. Pada untaian ini, DNA polimerase mampu membentuk DNA menggunakan ujung 3′-OH bebas dari sebuah primer RNA dan sintesis DNA berlangsung secara berkesinambungan, searah dengan arah pergerakan garpu replikasi.

Ujung 5 P (cabang “Lagging”)

Sintesis dimulai pada pangkal percabangan dan bergerak ke ujung cabang, maka setiap saat pergerakan penguraian helix ganda akan muncul titik awal baru yang diikuti oleh sintesis dengan arah ke bagian luar cabang

 Pada utas “lagging” sintesis berjalan secara diskontinu, dan akan ditemukan fragmen, Fragmen Okazaki (Reiji Okazaki, 1969)

Lagging strand ialah untaian DNA yang terletak pada sisi yang berseberangan dengan leading strand pada garpu replikasi. Untaian ini disintesis dalam segmen-segmen yang disebut fragmen Okazaki. Pada untaian ini, primase membentuk primer RNA. DNA polimerase dengan demikian dapat menggunakan gugus OH 3′ bebas pada primer RNA tersebut untuk mensintesis DNA dengan arah 5’→3′. Fragmen primer RNA tersebut lalu disingkirkan (misalnya dengan RNase H dan DNA Polimerase I) dan deoksiribonukleotida baru ditambahkan untuk mengisi celah yang tadinya ditempati oleh RNA. DNA ligase lalu menyambungkan fragmen-fragmen Okazaki tersebut sehingga sintesis lagging strand menjadi lengkap.

Garpu replikasi

Garpu replikasi atau cabang replikasi (replication fork) ialah struktur yang terbentuk ketika DNA bereplikasi. Garpu replikasi ini dibentuk akibat enzim helikase yang memutus ikatan-ikatan hidrogen yang menyatukan kedua untaian DNA, membuat terbukanya untaian ganda tersebut menjadi dua cabang yang masing-masing terdiri dari sebuah untaian tunggal DNA. Masing-masing cabang tersebut menjadi “cetakan” untuk pembentukan dua untaian DNA baru berdasarkan urutan nukleotida komplementernya. DNA polimerase membentuk untaian DNA baru dengan memperpanjang oligonukleotida yang dibentuk oleh enzim primase dan disebut primer.

DNA polimerase membentuk untaian DNA baru dengan menambahkan nukleotida—dalam hal ini, deoksiribonukleotida—ke ujung 3′-hidroksil bebas nukleotida rantai DNA yang sedang tumbuh. Dengan kata lain, rantai DNA baru disintesis dari arah 5’→3′, sedangkan DNA polimerase bergerak pada DNA “induk” dengan arah 3’→5′. Namun demikian, salah satu untaian DNA induk pada garpu replikasi berorientasi 3’→5′, sementara untaian lainnya berorientasi 5’→3′, dan helikase bergerak membuka untaian rangkap DNA dengan arah 5’→3′. Oleh karena itu, replikasi harus berlangsung pada kedua arah berlawanan tersebut.

Dinamika pada garpu replikasi

Bukti-bukti yang ditemukan belakangan ini menunjukkan bahwa enzim dan protein yang terlibat dalam replikasi DNA tetap berada pada garpu replikasi sementara DNA membentuk gelung untuk mempertahankan pembentukan DNA ke dua arah. Hal ini merupakan akibat dari interaksi antara DNA polimerase, sliding clamp, dan clamp loader.

Sliding clamp pada semua jenis makhluk hidup memiliki struktur serupa dan mampu berinteraksi dengan berbagai DNA polimerase prosesif maupun non-prosesif yang ditemukan di sel. Selain itu, sliding clamp berfungsi sebagai suatu faktor prosesivitas. Ujung-C sliding clamp membentuk gelungan yang mampu berinteraksi dengan protein-protein lain yang terlibat dalam replikasi DNA (seperti DNA polimerase dan clamp loader). Bagian dalam sliding clamp memungkinkan DNA bergerak melaluinya. Sliding clamp tidak membentuk interaksi spesifik dengan DNA. Terdapat lubang 35A besar di tengah clamp ini. Lubang tersebut berukuran sesuai untuk dilalui DNA dan air menempati tempat sisanya sehingga clamp dapat bergeser pada sepanjang DNA. Begitu polimerase mencapai ujung templat atau mendeteksi DNA berutas ganda, sliding clamp mengalami perubahan konformasi yang melepaskan DNA polimerase.

Clamp loader merupakan protein bersubunit banyak yang mampu menempel pada sliding clamp dan DNA polimerase. Dengan hidrolisis ATP, clamp loader terlepas dari sliding clamp sehingga DNA polimerase menempel pada sliding clamp. Sliding clamp hanya dapat berikatan pada polimerase selama terjadinya sintesis utas tunggal DNA. Jika DNA rantai tunggal sudah habis, polimerase mampu berikatan dengan subunit pada clamp loader dan bergerak ke posisi baru pada lagging strand. Pada leading strand, DNA polimerase III bergabung dengan clamp loader dan berikatan dengan sliding clamp.

Gambar 4. Replikasi dua arah (bidirectional replication)

Replikasi DNA Eukariota

Pada eukariota, replikasi DNA hanya terjadi pada fase S di dalam interfase. Untuk memasuki fase S diperlukan regulasi oleh sistem protein kompleks yang disebut siklin dan kinase tergantung siklin atau cyclin-dependent protein kinases (CDKs), yang berturut-turut akan diaktivasi oleh sinyal pertumbuhan yang mencapai permukaan sel. Beberapa CDKs akan melakukan fosforilasi dan mengaktifkan protein-protein yang diperlukan untuk inisiasi pada masing-masing ori.

Berhubung dengan kompleksitas struktur kromatin, garpu replikasi pada eukariota bergerak hanya dengan kecepatan 50 pb tiap detik. Sebelum melakukan penyalinan, DNA harus dilepaskan dari nukleosom pada garpu replikasi sehingga gerakan garpu replikasi akan diperlambat menjadi sekitar 50 pb tiap detik. Dengan kecepatan seperti ini diperlukan waktu sekitar 30 hari untuk menyalin molekul DNA kromosom pada kebanyakan mamalia.

Sederetan sekuens tandem yang terdiri atas 20 hingga 50 replikon mengalami inisiasi secara serempak pada waktu tertentu selama fase S. Deretan yang mengalami inisasi paling awal adalah eukromatin, sedangkan deretan yang agak lambat adalah heterokromatin. Daerah sentromer dan telomer dari DNA bereplikasi paling lambat. Pola semacam ini mencerminkan aksesibilitas struktur kromatin yang berbeda-beda terhadap faktor inisiasi.

Seperti halnya pada prokariota, satu atau beberapa DNA helikase dan Ssb yang disebut dengan protein replikasi A atau replication protein A (RP-A) diperlukan untuk memisahkan kedua untai DNA. Selanjutnya, tiga DNA polimerase yang berbeda terlibat dalam elongasi. Untai pengarah dan masing-masing fragmen untai tertinggal diinisiasi oleh RNA primer dengan bantuan aktivitas primase yang merupakan bagian integral enzim DNA polimerase a. Enzim ini akan meneruskan elongasi replikasi tetapi kemudian segera digantikan oleh DNA polimerase d pada untai pengarah dan DNA polimerase e pada untai tertinggal. Baik DNA polimerase d maupun e mempunyai fungsi penyuntingan. Kemampuan DNA polimerase d untuk menyintesis DNA yang panjang disebabkan oleh adanya antigen perbanyakan nuklear sel atau proliferating cell nuclear antigen (PCNA), yang fungsinya setara dengan subunit b holoenzim DNA polimerase III pada E. coli. Selain terjadi penggandaan DNA, kandungan histon di dalam sel juga mengalami penggandaan selama fase S.

Mesin replikasi yang terdiri atas semua enzim dan DNA yang berkaitan dengan garpu replikasi akan diimobilisasi di dalam matriks nuklear. Mesin-mesin tersebut dapat divisualisasikan menggunakan mikroskop dengan melabeli DNA yang sedang bereplikasi. Pelabelan dilakukan menggunakan analog timidin, yaitu bromodeoksiuridin (BUdR), dan visualisasi DNA yang dilabeli tersebut dilakukan dengan imunofloresensi menggunakan antibodi yang mengenali BUdR.

Ujung kromosom linier tidak dapat direplikasi sepenuhnya karena tidak ada DNA yang dapat menggantikan RNA primer yang dibuang dari ujung 5’ untai tertinggal. Dengan demikian, informasi genetik dapat hilang dari DNA. Untuk mengatasi hal ini, ujung kromosom eukariota (telomer) mengandung beratus-ratus sekuens repetitif sederhana yang tidak berisi informasi genetik dengan ujung 3’ melampaui ujung 5’. Enzim telomerase mengandung molekul RNA pendek, yang sebagian sekuensnya komplementer dengan sekuens repetitif tersebut. RNA ini akan bertindak sebagai cetakan (templat) bagi penambahan sekuens repetitif pada ujung 3’. Hal yang menarik adalah bahwa aktivitas telomerase mengalami penekanan di dalam sel-sel somatis pada organisme multiseluler, yang lambat laun akan menyebabkan pemendekan kromosom pada tiap generasi sel. Ketika pemendekan mencapai DNA yang membawa informasi genetik, sel-sel akan menjadi layu dan mati. Fenomena ini diduga sangat penting di dalam proses penuaan sel. Selain itu, kemampuan penggandaan yang tidak terkendali pada kebanyakan sel kanker juga berkaitan dengan reaktivasi enzim telomerase.

Mekanisme Replikasi Pada eukariot

Proses replikasi genom pada eukariot dapat dibagi kedalam tahapan:

Pengenalan titik ORI (titik awal replikasi)

Titik awal replikasi dinamakan Ori C, dapat dikenali oleh enzim Dna A yang dihasilkan oleh gen dnaA (pada E.coli) Terdapat berbagai jenis DnaA dan jenis Ori pada berbagai organisme, sehingga Satu jenis DNA dari satu organisme belum tentu dapat bereplikasi pada organisme  lain, karena tidak cocok Ori dengan Dna A.

Penguraian pilinan heliks ganda

  1. Memutuskan ikatan hidrogen antara basa-basa dari utasan yang berpasangan, memisahkan kedua utasan pada heliks ganda
  2. Mencegah utasan tunggal yang terbentuk berpasangan kembali membentuk heliks ganda
  3. Melindungi dari kerusakan akibat enzim nuklease yang banyak  terdapat dalam sel.
  4. Semua pekerjaan ini dilakukan oleh enzim helikase, girase DNA, dan protein SSB (single strand Binding protein)

Helikase merupakan Kelompok protein yang berfungsi menghilangkan ikatan hidrogen heliks ganda dan memisahkan menjadi utas tunggal

Jenis-jenis helikase lain

–          Helikase I (hasil gen tra I pada plasmid F) berperan dalam replikasi plasmid

–          Helikase II, III.

Girase menghilangkan tegangan superheliks

Enzim ini merupakan topoisomerase tipe II berfungsi untuk menghilangkan tegangan pada superheliks positif dengan cara membuka pilinan kearah negatif. Girase disusun oleh 2 jenis subunit protein yaitu: Sub unit A  oleh gen gyr A dan Sub unit B  oleh gen gyr B

Protein SSB melindungi utas tunggal

Kelompok protein khusus menempel dan berasosiasi dengan DNA utas tunggal, melindungi DNA dari serangan nuklease, yang dapat menghalangi transkripsi.Peran utamanya: Menstabilkan dan melindungi utas tunggal yang terbentuk selama replikasi DNA, perbaikan DNA dan rekombinasi

Sintesis rantai polinukleotida baru

Proses penggabungan mononukleotida menjadi rantai, enzim yang berperan :

  • Polimerase RNA
  • Polimerase DNA
  • Ligase

Inisiasi Sintesis oleh polimerase RNA atau primase

Proses replikasi semua fragmen okazaki diawali oleh RNA primer. Selanjutnya polimerase DNA memperpanjang rantai yang sudah ada. RNA primer dibentuk oleh primase (dihasilkan oleh gen dnaG atau oleh polimerase RNA (hasil gen rpo).

Sintesis perpanjangan rantai oleh polimerase DNA

Bertanggung jawab atas proses sintesis DNA baru dengan cara membentuk  ikatan fosfodiester yang merangkaikan C ke 5 satu nukleotida terhadap C ke 3 dari nukleotida lain.

Penyambungan berbagai fragmen okazaki menjadi satu rantai polinukleotida  utuh.  

Enzim ligase yang berperan untuk menyambung dua ujung rantai polinukleotida menjadi rantai yang lebih panjang.Ligase terdapat dimana-mana didalam sel dan bentuk berbeda-beda sesuai sumber energi yang dimanfaatkan.

Gambar 5. Gelembung replikasi

 Tulisan ini disusun oleh Eva Irawati




 
2 Komentar

Ditulis oleh pada 9 Mei 2011 in Biomolekuler

 

Tag: , ,

Elektroforesis


Elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen atau molekul bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik. Teknik ini dipelopori pada tahun 1937 oleh ahli kimia Swedia Arne Tiselius untuk pemisahan protein. Sekarang telah meluas ke banyak pemisahan kelas yang berbeda lain dari biomolekul termasuk asam nukleat, karbohidrat dan asam amino. Medan listrik dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel yang akan dipisahkan.

Teknik ini dapat digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada pada makromolekul, misalnya DNA yang bermuatan negatif. Jika molekul yang bermuatan negatif dilewatkan melalui suatu medium, kemudian dialiri arus listrik dari suatu kutub ke kutub yang berlawanan muatannya maka molekul tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif. Kecepatan gerak molekul tersebut tergantung pada muatan terhadap massanya serta tergantung pula pada bentuk molekulnya. Pergerakan ini dapat dijelaskan dengan gaya Lorentz, yang terkait dengan sifat-sifat dasar elektris bahan yang diamati dan kondisi elektris lingkungan:


F adalah gaya Lorentz, q adalah muatan yang dibawa oleh objek, E adalah medan listrik.Secara umum, elektroforesis digunakan untuk memisahkan, mengidentifikasi, dan memurnikan fragmen DNA.

Jenis-Jenis Elektroforesis dan Cara Kerja

 1.    Elektroforesis Kertas

Kisah teknik pemisahan DNA/RNA ini berawal dari sekelompok ilmuwan biokimia di awal tahun 1950-an yang sedang meneliti mekanisme molekular DNA/RNA hidrolisis. Saat itu, tepatnya tahun 1952, Markham dan Smith mempublikasikan bahwa hidrolisis RNA terjadi melalui mekanisme pembentukan zat antara (intermediate) posfat siklik, yang kemudian menghasilkan nukleosida 2′-monoposfat dan 3′-monoposfat. Ternyata mereka menggunakan suatu peralatan yang dapat memisahkan komponen campuran reaksi hidrolisis tadi, salah satunya yaitu nukleotida ‘siklik’ yang membawa pada kesimpulan bahwa hidrolisis RNA terjadi melalui pembentukan intermediate posfat siklik. Peralatan itu dinamakan ‘elektroforesis‘, yang dibuat dari kertas saring Whatman nomor 3, sebuah tangki kecil dan berbagai larutan penyangga (buffer). Nukleotida yang sudah terhidrolisis ditaruh di atas kertas saring, kemudian arus listrik dialirkan melalui kedua ujung alat elektroforesis.

Arus listrik yang dialirkan ini ternyata dapat memisahkan campuran kompleks reaksi tadi menjadi komponen-komponennya, ini akibat adanya perbedaan minor antara struktur molekul RNA yang belum terhidrolisis, zat antara (intermediate) dan hasil reaksi (nukleosida 2′-monoposfat dan nukleosida 3′-monoposfat) yang menyebabkan mobilitas alias pergerakan mereka pada kertas saring berbeda-beda kecepatannya. Karena pada akhir proses elektroforesis komponen tersebut terpisah-pisah, sehingga dapat mengisolasi dan mengidentifikasi setiap komponen tersebut.

          Gambar Elektroforesis Kertas

Elektroforesis kertas adalah jenis elektroforesis yang terdiri dari kertas sebagai fase diam dan partikel yang terlarut sebagai fase gerak, terutama ion-ion kompleks. Pemisahan ini terjadi akibat adanya gradasi konsentrasi sepanjang system pemisahan. Pergerakan partikel dalam kertas tergantung pada muatan atau valensi zat terlarut, luas penampang, tegangan yang digunakan, konsentrasi elektrolit, kekuatan ion, pH, viskositas, dan adsorbsivitas zat terlarut.

2. Elektroforesis Gel Kanji

Selanjutnya teknik elektroforesis dikembangkan untuk memisahkan biomolekul yang lebih besar. Tahun 1955 Smithies mendemonstrasikan bahwa gel yang terbuat dari larutan kanji dapat digunakan untuk memisahkan protein-protein serum manusia. Caranya yaitu dengan menuangkan larutan kanji panas ke dalam cetakan plastik, setelah dibiarkan mendingin kanji tersebut akan membentuk gel yang padat namun rapuh. Gel kanji berperan sebagai fasa diam (stationary phase) menggantikan kertas saring Whatman pada teknik terdahulu. Ternyata elektroforesis gel yang diperkenalkan Smithies memicu para ilmuwan untuk menemukan bahan kimia lain yang dapat digunakan sebagai bahan gel yang lebih baik, seperti agarosa dan polimer akrilamida.  Dan penemuan elektroforesis gel kanji di awal karir Smithies membawanya menerima hadiah nobel bidang kedokteran tahun 2007.

              

Gambar Elektroforesis Gel Kanji                   Gambar Elektroforesis Gel

Teknik elektroforesis gel makin berkembang dan disempurnakan, hingga 12 tahun kemudian ditemukan gel poliakrilamida (PAGE = Polyacrilamide Gel Electrophoresis) yang terbentuk melalui proses polimerisasi akrilamida dan bis-akrilamida. PAGE ini sanggup memisahkan campuran DNA/RNA atau protein dengan ukuran lebih besar. Meskipun aplikasi elektroforesis makin berkembang luas, namun ternyata teknik ini masih menyerah jika digunakan untuk memisahkan DNA dengan ukuran yang super besar, misalnya DNA kromosom. Campuran DNA kromosom tidak dapat dipisahkan meskipun ukuran mereka berbeda-beda.

Gambar Prosedur Kerja Elektroforesis Gel

Adapun prosedur kerja dalam melakukan elektroforesis DNA menggunakan teknik elektroforesis gel agarosa sebagai berikut :

Bahan dan Alat

  1. DNA marker, misalnya DNA λ yang dipotong dengan HindIII
  2. Sampel DNA, misalnya :
  3. DNA kromosom bakteri,
  4. DNA plasmid hasil isolasi (uncut)
  5. DNA plasmid hasil restriksi (cut)
  6. Agarosa
  7. Larutan buffer TAE 50x (242 g tris-base; 57,1 g asam asetat glacial; 100 ml EDTA 0,5 M pH 8; dilarutkan dalam akuades hingga 1000 ml)
  8. Akuades
  9. Gelas Ukur 1000 ml
  10. Labu Erlenmeyer 50 ml
  11. Tabung mikrosentrifuga
  12. Sarung tangan
  13. Seperangkat mikropipet beserta tipnya (Bio-Rad dan Axygen Scientific)
  14. Kertas parafilm
  15. seperangkat alat elektroforesis
  16. Loading dye 6x (0,25% bromophenol blue; 0,25% xylene cyalol; 15% ficoll tipe 4000; EDTA 120 mM)
  17. larutan Etidium Bromid (EtBr)
  18. UV transluminator
  19. Kaca mata UV
  20. kamera digital

Cara Kerja

  1. Buat 250 ml larutan buffer TAE 1x dengan cara mencamnpurkan 5 ml TAE 50x ke dalam 245 ml akuades.
  2. Buat gel agarosa 1% dengan cara menimbang agarosa 0,2 g untuk dilarutkan ke dalam bufer TAE 1x hingga volume 20 ml. Larutan agarosa dididihkan hingga larut sempurna.
  3. Siapkan baki gel agarosa, lekatkan selotip di tiap ujung baki gel agarosa (pastikan bahwa selotip melekat kuat dan tidak ada lubang pada masing-masing ujung baki)
  4. Pasang sisir elektroforesis di salah satu ujung baki gel agarosa dengan posisi hampir menyentuh dasar baki
  5. Periksalah suhu larutan agarosa dengan cara menempelkan erlenmeyer ke tangan, jika suhunya sudah turun hingga sekitar 50-60 0C, tambahkan 1 µl etidium bromid (PERINGATAN KERAS!!, gunakan sarung tangan karena bersifat karsinogenik).
  6. Larutan agarosa dihomogenkan sebentar, kemudian tuangkan larutan ke dalam baki gel agarosa, biarkan hingga larutan berubah menjadi gel yang padat.
  7. ambil sisir dengan hati-hati, lepaskan selotip dari ujung-ujung baki.
  8. masukkan baki yang telah berisi gel agarosa ke dalam tangki elektroforesis yang telah diisi dengan larutan bufer TAE 1x (pastikan bahwa gel terendam seluruhnya dalam TAE).
  9. siapkan sekitar 5 cm kertas parafilm di dekat tangki elektroforesis.
  10. masukkan 10 µl sampel DNA dan 2 µl loading dye 6x ke dalam sumuran gel agarosa dengan cara mencampurkan kedua bahan tersebut terlebih dahulu secara merata pada kertas parafilm menggunakan mikropipet.
  11. buatlah catatan mengenai nomor sumuran dan jenis sampel DNA yang dimasukkan.
  12. hubungkan kabel dari sumber arus ke tangki elektroforesis (pastikan bahwa kabel yang tersambung ke kutub negatif berada di dekat sumuran; jika tidak demikian, ubahlah posisi baki/gel ke arah sebaliknya).
  13. nyalakan sumber arus, aturlah volatase dan waktu running hingga diperoleh angka 70 V dan 45 menit dengan cara menekan tombol yang sesuai pada sumber arus.
  14. jalankan elektroforesis (lakukan running) dengan cara menekan tombol run pada sumber arus.
  15. elektroforesis akan berhenti apabila waktu yang ditetapkan sudah habis, yang ditandai oleh adanya bunyi alarm. Matikan sumber arus dan angkatlah baki dari tangki elektroforesis.
  16. keluarkan gel dan letakkan di atas UV transluminator (letakkan selubung kaca hitam di atas UV transluminator).
  17. nyalakan UV transluminator, amati pita-pita DNA yang tervisualisasi.

Hasil

Pita-pita DNA hasil elektroforesis dengan nomor sumuran dan jenis sampelnya. Perkirakan ukuran masing-masing fragmen/pita dengan membandingkannya dengan posisi migrasi pada DNA marker. Metode ini didasarkan pada pergerakan molekul bermuatan dalam media penyangga matriks stabil, di bawah pengaruh  medan listrik. Media yang umum digunakan adalah sel agarosa atau poliakrilamid. Elektroforesis gel agarosa digunakan untuk memisahkan fragmen DNA yang berukuran lebih besar dari 100 pb dan dijalankan secara horizontal, sedangkan elektroforesis poliakrilamid dapat memisahkan 1 pb dan dijalankan secara vertical. Elektroforesis poliakrilamid biasanya digunakan untuk menentukan DNA (sekuensing).

Larutan yang bermuatan negatif dimasukkan ke dalam sumur-sumur yang terdapat pada gel agarosa dan diletakkan di kutub negatif, apabila dialiri arus  listrik dengan menggunakan larutan buffer yang sesuai maka DNA akan bergerak  ke kutub positif. Laju migrasi DNA dalam medan listrik berbanding terbalik dengan massa DNA. Migrasi DNA terutama ditentukan oleh ukuran panjang  dan bentuk DNA. Fragmen DNA yang berukuran kecil akan bermigrasi lebih cepat dibandingkan yang berukuran besar, sehingga elektroforesis mampu memisahkan  fragmen DNA berdasarkan ukuran panjangnya. Untuk visualisasi maka ditambahkan larutan etidium bromida yang akan masuk diantara ikatan hydrogen pada DNA, sehingga pita fragmen DNA akan kelihatan dibawah lammpu UV. Panjang amplikon bisa diperkirakan dengan membandingkannya dengan pita DNA standar.

Karena pita-pita atau puncak-puncak protein terlalu rapat cenderung saling tumpah-tindih, metode pemisahan satu dimensi, seperti elektroforesis gel poliakrilamida SDS atau kromatografi, hanya mampu menguraikan protein dalam jumlah yang relatif  kecil (umumnya kurang dari 50). Sehingga digunakan elektroforesis gel dua dimensi yang menggabungkan dua prosedur pemisahan yang berbeda. metode ini dapat menguraikan lebih dari 1000 macam protein melalui pemetaan dua dimensi.

3. Pulse-Field Gel Electrophoresis (PFGE)

Pertengahan 1980-an, Schwartz dan Cantor memberitahukan ide cerdasnya untuk memisahkan campuran DNA berukuran super besar menggunakan teknik yang dinamakan Pulse-field Gradient Gel Electrophoresis (PFGE), yang menggunakan pulsa-pulsa pendek medan listrik tegak lurus yang arahnya berganti-ganti. Teknik PFGE kini digunakan secara luas oleh para ahli biologi dalam studi genotyping berskala masif, juga analisa epidemiologi molekular pada patogen.

Keempat teknik di atas merupakan pintu masuk bagi penelitian-penelitian lainnya dalam bidang biologi molekular yang kini berkembang sangat pesat. Sulit dibayangkan sebuah laboratorium biologi molekular dapat menghasilkan sesuatu tanpa teknik elektroforesis. Tanpa elektroforesis, DNA/RNA yang sedang kita teliti akan bercampur dengan kontaminan yang tidak kita inginkan, sulit pula membayangkan cara mengetahui ukuran DNA/RNA/protein yang lebih praktis selain dengan elektroforesis, bahkan teknik DNA sequencing modern sekalipun sangat bergantung pada teknik elektroforesis ini.

Gambar Pulse-field Gradient Gel Electrophoresis (PFGE)

Elektroforesis digunakan untuk meneliti DNA dalam berbagai bidang, misalnya :

  1. Di bidang kepolisian teknik ini digunakan nuntuk pemeriksaan DNA, setiap orang memiliki karakteristik khusus, misalnya sidik jari. Sehingga membantu polisi dalam mengungkap sebuah kasus.
  2. Dalam kegiatan biologi molekuler, elektroforesis merupakan salah satu cara untuk memvisualisasikan keberadaan DNA, plasmid, dan produk PCR.
  3. Memudahkan identifikasi protein yang terdapat pada sebuah DNA.

Disusun oleh Ulfa Tryani S.Si, S.Pd dari berbagai sumber

 
14 Komentar

Ditulis oleh pada 8 Mei 2011 in Biomolekuler

 

Tag: , , , ,

Transposisi


Transposisi adalah suatu proses perpindahan elemen genetik dari satu lokus dalam suatu kromosom, plasmid, atau genom virus, ke bagian lain kromosom yang sama, atau bahkan ke suatu lokus dalam kromosom lain (Yuwono, 2005: 245).

Kebanyakan gen terletak pada sebuah lokus atau posisi spesifik pada kromosom. Akan tetapi, sejumlah gen atau set gen yang teratut erat bisa memerantai pergerakannya sendiri dari satu lokasi ke lokasi lain. Gen tersebut juga bisa terdapat dalam banyak salinan (terkadang ratusan atau ribuan) yang tersebar di sepanjang genom. Unsur-unsur tersebut telah diberi berbagai sebutan, yaitu “gen melompat”, “elemen bergerak (mobile)”, “sekuens insersi”, “kaset”, dan “transposon” (Elrod, S. dan Stansfield, W, 2007).

Transposon merupakan elemen genetik yang berpindah dapat berupa satu gen atau beberapa gen yang bertaut (linkage) sehingga disebut juga elemen genetik yang dapat bertransposisi (transposable genetic elements) atau unsure transposable (Yuwono, 2005: 245). Transposon disebut juga dengan gen loncat (jumping genes), elemen genetik bergerak (mobile genetic element), sekuensi insersi, dan kaset (Addy, 2009).

Elemen genetik yang dapat bertransposisi tersebut ditemukan baik dalam prokaryot, eukaryot, maupun dalam bakteriofag. Semua transposon membawa kode genetik untuk satu atau lebih dari satu protein yang diperlukan untuk transposisi. Di samping itu, beberapa transposon juga membawa gen lain yang menghasilkan fenotipe tertentu, misalnya ketahanan terhadap antibiotik tertentu (Yuwono, 2005: 245).

Dalam beberapa hal, proses transposisi mirip dengan proses rekombinasi khusus, yaitu melibatkan proses pemotongan untai DNA baik pada molekul DNA donor maupun DNA target pada tempat khusus. Proses tersebut kemudian diikuti dengan penggabungan ujung-ujung transposon ke molekul DNA target yang sudah terpotong. Walaupun demikian, ada perbedaan mendasar antara proses transposisi dengan proses rekombinasi khusus. Ciri penting transposisi adalah proses transposisi tidak tergantung pada ada atau tidaknya hubungan antara urutan nukleotida pada DNA donor dengan DNA target, baik hubungan fungsional maupun, misalnya, hubungan asal-usul. Dalam proses rekombinasi khusus, pemotongan dan penyambungan molekul DNA donor dan DNA target tidak disertai dengan sintesis molekul DNA baru. Sebaliknya, proses transposisi melibatkan sintesis molekul DNA baru yang dikendalikan oleh sistem reparasi atau replikasi. Selain itu, selama transposisi, molekul DNA donor tidak disusun kembali seperti bentuk tipe alami pra-transposisi (Yuwono, 2005: 247).

Transposisi dapat menyebabkan terjadinya penyusunan kembali (rearrangement) genom suatu jasad. Hal ini dapat terjadi, misalnya karena ada dua duplikat (copy) transposon yang sama pada lokasi kromosom yang berbeda sehingga dapat menyebabkan terjadinya rekombinasi antarduplikat transposon tersebut. Rekombinasi semacam itu dapat membawa implikasi terjadinya delesi, penyisipan, inversi, atau translokasi. Transposisi mempunyai peranan dalam proses evolusi beberapa plasmid bakteri. Sebagai contoh, integrasi plasmid F yang berasal dari E. coli ke dalam kromosom bakteri seringkali terjadi melalui proses rekombinasi antara suatu transposon yang ada di dalam plasmid dengan transposon yang homolog di dalam kromosom bakteri (Yuwono, 2005: 247).

Gambar Transposisi (Gerakan Transposon)

McClintock menemukan bahwa transposon bertanggung jawab untuk berbagai jenis mutasi gen, biasanya berupa:

  • penyisipan,
  • penghapusan, dan
  • translokasi (Kimbal).

Perubahan dalam genom bisa, misalnya, menyebabkan perubahan warna biji jagung. Sekitar 50% dari total genom jagung terdiri dari transposon (elemen Ac/Ds). Pada bakteri, ditemukan elemen IS yang pertama kali ditemukan pada gen Escherichia coli oleh James Shapiro pada tahun 1968. Dirangsang oleh laporan Shapiro tersebut, tindak lanjut penelitian biologi molekular tentang keterlibatan dalam berbagai fenomena transposon DNA mobile terkait pada bakteri, tanaman, dan serangga. Penemuan Barbara McClintock yang sebelumnya pada jagung diberi pengakuan yang luas di antara ahli biologi. Akhirnya, McClintock memperoleh pengakuan berupa penghargaan Nobel di bidang Fisiologi atau Kedokteran pada tahun 1983. Jadi, butuh waktu sekitar 40 tahun bagi para ilmuwan lain untuk sepenuhnya menghargai pentingnya penemuan McClintock.

Dalam mengembangkan jaringan somatik seperti biji jagung, mutasi yang mengubah warna akan diteruskan ke semua sel keturunan. Ini menghasilkan pola beraneka ragam yang begitu dihargai di “jagung India” (Kimbal). Satu keluarga transposon pada lalat buah Drosophila melanogaster disebut unsur P. transposon tampaknya memiliki pertama kali muncul di satu-satunya spesies di pertengahan abad kedua puluh. Dalam 50 tahun, mereka telah menyebar melalui setiap populasi spesies. P buatan elemen dapat digunakan untuk menyisipkan gen ke Drosophila dengan menyuntikkan embrio (Kimbal).

Pada masa kini, transposon dianggap sebagai relik (peninggalan) evolusi dari masa lalu dan dianggap sebagai sisa-sisa virus yang telah terintegrasi ke dalam genom suatu organism (Citizendium). Pada mulanya, transposon diduga sebagai fragmen yang tidak berguna atau disebut “sampah” DNA dan “egois” DNA hingga akhirnya diketahui bahwa transposon ternyata memiliki peranan penting dalam perkembangan organism (Addy, 2009).  “Sampah” DNA karena tidak ada manfaat yang jelas bagi inang mereka. Sedangkan, “egois” DNA karena transposon tampaknya hanya berfungsi untuk membuat salinan bagi diri mereka sendiri (Jkimball: 2010).

Yuwono (2005: 258) mengatakan bahwa transposon mempunyai peranan penting dalam evolusi dan organisasi genom jasad hidup. Pada beberapa jasad, misalnya jagung, transposon terkonsentrasi pada daerah DNA di antara gen yang secara total meliputi lebih dari setengah (50%) genom jagung. Pada Drosophila, transposon terdapat pada heterokromatin maupun eukromatin dan diketahui ada sekitar 90 famili transposon pada genom Drosophila. Pada Drosophila, transposon diketahui terlibat dalam proses evolusi genom melalui proses penyusunan ulang genom (genom rearrangement).

Transposon juga diketahui sebagai salah satu penyebab terjadinya mutasi pada banyak organisme. Misalnya, pada Drosophila, mutasi pada gen white (bertanggung jawab pada pembentukan warna mata) disebabkan oleh penyisipan beberapa macam transposon. Penyebaran elemen transposon yang luas pada genom jasad memberikan gambaran bahwa elemen genetik tersebut mempunyai peranan dalam proses evolusi jasad hidup (Yuwono, 2005: 258).

Berdasarkan mekanisme perpindahan (transposisi), transposon dapat di kelompokkan menjadi tiga kategori, yaitu transposon potong-tempel, transposon repliktif, dan retrotransposon.

Transposon potong-tempel

Transposon potong-tempel (cut-and-paste transposon) dapat berpindah dari satu lokus ke lokus lain dengan cara dipotong dari satu lokus pada kromosom dan ditempelkan pada lokus lain yang dapat terletak pada kromosom yang berbeda (Yuwono, 2005).

Transposon replikatif

Transposon replikatif (replicative transposon) mengalami transposisi dengan melibatkan proses replikasi elemen DNA transposon. Enzim transposase yang dikode oleh elemen genetik tersebut berperan di dalam proses interaksi dengan sisi tempat penyisipan transposon. Dalam interaksi tersebut, elemen DNA transposon direplikasi dan salah satu turunan (copy) disisipkan pada sisi baru, sedangkan elemen DNA aslinya tetap berada di sisi semula (Yuwono, 2005).

Retrotransposon

Retrotransposon disebut juga jenis transposon kelas I yang dapat digambarkan sebagai copy and paste. Retrotransposon menyalin dirinya dalam dua tahap, pertama dari DNA ke RNA dengan transkripsi. Kemudian, dari RNA kembali ke DNA oleh transkripsi balik. Salinan DNA ini kemudian dimasukkan ke genom pada posisi baru. Transkripsi balik dikatalisis oleh enzim transkriptase yang sering dikodekan oleh transposon sendiri (Anonim, 2009).

Menurut Yuwono (2005) bahwa retrotransposon dapat mengalami trasposisi dengan cara melakukan proses transkripsi balik (reverse transcription) untuk mengubah elemen genetik berupa RNA menjadi DNA. Proses ini dikatalisis oleh enzim transkriptase balik (reverse transcriptase). Setelah DNA terbentuk, dilakukan penyisipan ke dalam sisi target. Beberapa elemen genetik yang mengalami transposisi dengan cara ini mempunyai kaitan dengan retrovirus sehingga transposon semacam ini sering disebut elemen yang mempunyai retrovirus (retrovirus-like elements).

Mekanisme transposisi pada prokaryot

Mekanisme transposisi secara detail sampai saat ini belum diketahui dengan jelas. Namun, pada prokaryot, misalnya E. coli, transposisi terjadi melalui dua cara, yaitu replikatif dan konservatif (nonreplikatif) (Yuwono, 2005).

Mekanisme transposisi beberapa transposon dapat dilihat pada Tabel  berikut ini.

Penggolongan transposon berdasarkan mekanisme transposisi

Kategori                                 Contoh Transposon                          Organisme
I. Transposon                          * Elemen IS (Insertion sequence,        Bakteri

potong-tempel                        misalnya: IS50)

* Transposon komposit                       Bakteri

(misalnya: Tn5)

* Elemen Ac/Ds                                  Jagung

* Elemen P                                          Drosophila

                                                * Elemen mariner                               Drosophila

* Elemen hobo                                    Drosophila

* Elemen Tc1                                      Nematoda

II. Transposon replikatif         Elemen Tn3                                         Bakteri

III. Retrotransposon

  1. Elemen serupa             * Ty1                                                   Khamir

retrovirus (disebut          * copia                                                 Drosophila

juga long terminal       * gypsy                                                Drosophila

               repeat, LTR).

  1. Retroposon                  * Elemen F, G, dan I                          Drosophila

                                              * Retroposon yang spesifik                   Drosophila

pada telomer

* LINE (misalnya L1)                         Manusia

* SINE (misalnya Alu)                        Manusia

Sumber: Snutad & Simmons, 2003 dalam Yuwono, 2005.

 Transposisi secara replikatif akan dibentuk duplikat elemen transposon pada tempat yang baru dan satu duplikat transposon pada tempat yang lama. Sedangkan, transposisi secara konservatif tidak terjadi replikasi sehingga disebut nonreplikatif, transposisi terjadi dengan cara pemotongan elemen transposon dari kromosom atau plasmid dan transposon tersebut kemudian diintegrasikan ke tempat yang baru (Yuwono, 2005).

Transposisi secara replikatif ada dua model antara dua plasmid, yaitu model simetris (model Shapiro) dan model asimetris. Model tranpososisi secara simetris, yaitu tranpososisi terjadi melalui pembentukan elemen genetik lingkar yang merupakan gabungan antara kedua plasmid (cointegrate) dan mengandung dua duplikat tranpososon dengan orientasi yang sama. Cointegrate tersebut kemudian akan diuraikan lebih lanjut sehingga akan dihasilkan dua elemen plasmid baru yang masing-masing akan mengandung satu tranpososon. Dalam model ini, pembentukan cointegrate merupakan suatu keharusan. Sebaliknya, menurut asimetris, pembentukan cointegrate tidak merupakan keharusan namun hanya merupakan salah satu kemungkinan hasil antara yang dapat terjadi. Tranpososisi secara replikatif tersebut dapat terjadi misalnya pada bakteriofag Mu dan Tn3 (Yuwono, 2005).


Gambar Mekanisme Transposisi secara Replikatif pada Tn3

Gambar Mekanisme Transposisi secara Nonreplikatif

Transposon pada manusia

            Hasil penentuan urutan nukleotida (DNA sequencing)  kromosom manusia menunjukkan bahwa paling tidak sekitar 44% DNA manusia berasal dari elemen transposon, termasuk elemen yang menyerupai virus (8% dari genom yang sudah disekuen), retroposon (33%), dan beberapa family transposon yang mengalami transposisi dengan mekanisme potong tempel (3%). Salah satu transposon yang dominan adalah elemen1 (retroposon) yang merupakan sekuens kelompok LINE (long interspersed nuclear element). Elemen L1 yang lengkap berukuran sekitar 6 kb, mempunyai promoter internal yang ditanskripsi oleh RNA polymerase II, dan mempunyai dua ORF, yaitu ORF1 (mengkode protein pengikat DNA) dan ORF2 (mengkode endonuklease dan transcriptase balik) genom manusia mengandung sekitar 3.000 sampai 5.000 elemen L1 yang lengkap. Selain itu, ditemukan juga ada sekitar 500.000 elemen L1 yang tidak lengkap karena terpotong ujung 5’ sehingga tidak mampu ditransposisi (Yuwono, 2005).

            Elemen L1 merupakan retroposon yang otentik. Transposisi elemen ini melibatkan proses transkripsi elemen L1 menjadi RNA yang kemudian diikuti dengan proses transkripsi balik menjadi DNA. Kedua proses tersebut terjadi di dalam nukleus, meskipun sebelum ditranskripsi balik elemen tersebut ditransfer ke sitoplasma untuk ditranslasi menjadi polipeptida yang terikut sampai ke dalam nukelus. Endonuklease yang dikode oleh ORF2 berfungsi untuk mengkatalisis pemotongan DNA untai ganda pada sisi yang prospektif untuk digunakan sebagai tempat penyisipan. Hasil penelitian menunjukkan bahwa jumlah elemen L1 yang aktif mengalami transposisi hanya sedikit. Selain itu, juga diketahui bahwa beberapa penyakit pada manusia disebabkan oleh mutasi karena penyisipan oleh elemen L1. Misalnya, mutasi pada gen faktor VIII yang menyebabkan hemophilia. Genom manusia juga mengandung elemen LINE yang lain, yaitu L2 (315 kopi), dan L3 (37.000 kopi) (Yuwono, 2005).

            Elemen lain selain LINE yang juga banyak terdapat pada genom manusia adalah SINE (short interspersed nuclear element) yang berukuran sekitar 400 pasang nukleotida dan tidak mengkode suatu protein. SINE mengalami transposisi melalui proses transkripsi balik. Enzim yang digunakan untuk proses transkripsi balik (enzim transcriptase balik) tersebut tampaknya disintesis dari elemen LINE. Dengan demikian, proses perbanyakan SINE tergantung pada elemen LINE. Genom manusia mengandung tiga famili SINE, yaitu elemen Alu, MIR, dan Ther2/MIR3 meskipun yang mengalami transposisi secara aktif hanya elemen Alu (Yuwono, 2005).

            Genom manusia mengandung lebih dari 400.000 sekuens yang berasal dari elemen yang menyerupai virus. Seperti halnya elemen LINE dan SINE yang tidak aktif, hampir semua elemen yang menyerupai virus pada genom manusia merupakan “fosil genetik” (Yuwono, 2005).

 




 
Tinggalkan komentar

Ditulis oleh pada 8 Mei 2011 in Biomolekuler

 

Tag: , , , , , ,

Translasi pada Prokariotik


Translasi adalah proses penerjemahan urutan nukleotida/kode-kode genetik yang ada pada molekul mRNA menjadi urutan rangkaian asam-asam amino yang menyusun suatu polipeptida atau protein, (Yuwono, T. 2005).

Pada proses translasi hanya molekul mRNA yang ditranslasi, sedangkan rRNA dan tRNA tidak ditranslasi, yaitu dilakukan secara hampir serentak dengan proses transkripsi, artinya sebelum transkripsi selesai maka proses translasi sudah dimulai. Hal ini disebabkan oleh perbedaan dalam hal struktur sel prokaryot sangat sederhana dan belum ada pembagian ruang sehingga molekul DNA genom berada di dalam sitoplasma bersama-sama dengan komponen sel yang lain. Dengan demikian, molekul mRNA hasil transkripsi dapat langsung melakukan kontak dengan ribosom sebelum untaian mRNA tersebut selesai disintesis.

Translasi dapat berlangsung memerlukan 3 komponen:

  1. Molekul mRNA merupakan transkrip (salinan) urutan DNA yang menyusun suatu gen dalam bentuk ORF (open reading frame, kerangka baca terbuka), didalamnya terdapat rangkaian kodon-kodon yang akan diterjemahkan.
  2. Molekul tRNA merupakan pembawa asam-asam amino yang akan disambungkan menjadi rantai polipeptida, tRNA sebagai penterjemah, yang membawa antikodon.
  3. Ribosom merupakan tempat penterjemahan berlangsung/proses translasi, disusun oleh molekul rRNA dan beberapa macam protein, ribosom tersebar diseluruh bagian sel.

 ORF dicirikan oleh:

  1. Kodon inisiasi translasi, yaitu urutan ATG (pada DNA) atau AUG (pada mRNA).
  2. Terdapat serangkaian urutan nukleotida yang menyusun banyak kodon yang dibaca tiap tiga nukleotida sebagai satu kodon untuk satu asam amino, dan pembacaan dimulai dari urutan kodon metionin (ATG pada DNA atau AUG pada mRNA).
  3. Kodon terminasi translasi, yaitu TAA (UAA pada mRNA), TAG (UAG pada mRNA), atau TGA (UGA pada mRNA).

Translasi, atau pada hakekatnya sintesis protein, berlangsung di dalam ribosom, suatu struktur organel yang banyak terdapat di dalam sitoplasma. Ribosom terdiri atas dua subunit, besar dan kecil, yang akan menyatu selama inisiasi translasi dan terpisah ketika translasi telah selesai. Ukuran ribosom sering dinyatakan atas dasar laju pengendapannya selama sentrifugasi sebagai satuan yang disebut satuan Svedberg (S). Pada jasad prokaryot, subunit kecil mempunyai koefisien sedimentasi sebesar 30S sedangkan subunit besar berukuran 50S,  tetapi pada saat kedua unit tersebut bergabung koefisien sedimentasinya adalah 70S, sedangkan pada jasad eukaryot, subunit kecil berukuran 40S, sedangkan subunit besar berukuran 60S, tetapi pada saat kedua unit tersebut bergabung koefisien sedimentasinya adalah 80S. Tiap ribosom mempunyai dua tempat pengikatan tRNA, yang masing-masing dinamakan tapak aminoasil (tapak A) dan tapak peptidil (tapak P). Molekul aminoasil-tRNA yang baru memasuki ribosom akan terikat di tapak A, sedangkan molekul tRNA yang membawa rantai polipeptida yang sedang diperpanjang terikat di tapak P. Gambaran penting sintesis protein adalah bahwa proses ini berlangsung dengan arah tertentu sebagai berikut.
Molekul mRNA ditranslasi dengan arah 5’→ 3’, tetapi tidak dari ujung 5’ hingga ujung 3’. Polipeptida disintesis dari ujung amino ke ujung karboksil dengan menambahkan asam-asam amino satu demi satu ke ujung karboksil. Sebagai contoh, sintesis protein yang mempunyai urutan NH2-Met-Pro-Gly-Ser-COOH pasti dimulai dengan metionin dan diakhiri dengan serin.

  1. Faktor-Faktor Translasi Prokaryot

FAKTOR

FUNGSI

INISIASI

IF1

IF2

IF3

Pemisahan sub unit ribosomPengikatan tRNA fmet untuk kompleks inisiasi

Pemisahan ribosom, pengikatan pada mRNA untuk kompleks inisiasi

ELONGASI

EF-Tu

EF-Ts

EF-G

Pengikatan aminoacyl-tRNA ke A siteMenghasilkan EF-Tu

Translokasi

TERMINASI

RF1

RF2

RF3

Pelepasan rantai –UAA,UAGPelepasan rantai UGA,UAA

Bekerja sama dengan RF1 dan RF2

(Sumber: Hartati, 2010.)

Translasi terdiri dari 3 tahap :

Inisiasi (initiation)

Tahap pertama pada inisiasi dimulai dengan disosiasi/pemisahan ribosom 70S menjadi subunit besar (50S) dan subunit kecil (30S) dengan menggunakan faktor IF-1, kemudia pada tahapan inisiasi ini subunit ribosom 30S terbebas dari ikatan dengan subunit 50S melalui interaksinya dengan protein IF-3, kemudian terjadinya penggabungan mRNA, subunit 30S, dan formilmetionil-tRNAf (fMet-tRNAf) membentuk kompleks inisiasi 30S dengan membutuhkan GTP (guanosin triphosphat) dan beberapa protein/faktor inisiasi (IF-1, IF-2, IF-3) yang dilakukan oleh IF-2, IF-3. IF-3 tersebut akan mengikat pada subunit 30S (ribosom kecil), setelah kompleks inisiasi 30S terbentuk selanjutnya subunit 50S (ribosom besar) bergabung dan membentuk kompleks inisiasi 70S dengan menggunakan energi hasil hidrolisis GTP yang terjadi pada waktu IF-1, IF-2 dan IF-3 terlepas dari kompleks, kompleks inisiasi 70S inilah yang siap melakukan proses pemanjangan polipeptida.

  1. Pemanjangan (elongation)

Proses pemanjangan polipeptida secara umum mempunyai mekanisme 3 tahapan: 1) pengikatan aminoasil –tRNA pada sisi A yang ada di ribosom, 2) pemindahan rantai polipeptida yang tumbuh dari tRNA yang ada pada sisi P ke arah sisi A dengan membentuk ikatan peptide, 4) translokasi ribosom sepanjang mRNA ke posisi kodon selanjutnya yang ada di sisi A.

Di dalam kompleks ribosom, molekul fMet-tRNAf Met menempati sisi P (peptidil), sisi yang lain pada ribosom, yaitu sisi A (aminoasil), masih kosong pada saat awal sintesis protein. Berpasangannya triplet kodon inisiasi  (AUG/GUG) pada mRNA dengan antikodon pada metionil-tRNAfMet di tapak P menentukan urutan triplet kodon dan aminoasil-tRNAfMet berikutnya yang akan masuk ke tapak A. Pengikatan aminoasil-tRNAfMet berikutnya, misalnya alanil- tRNAala, ke tapak A memerlukan protein-protein elongasi EF-Ts dan EF-Tu. Pembentukan ikatan peptida antara gugus karboksil pada metionil-tRNAfMet di tapak P dan gugus amino pada alanil-tRNAala di tapak A dikatalisis oleh enzim peptidil transferase, suatu enzim yang terikat pada subunit ribosom 50S. Reaksi ini menghasilkan dipeptida yang terdiri atas f-metionin dan alanin yang terikat pada tRNAala di tapak A. Langkah berikutnya adalah translokasi, yang melibatkan (1) perpindahan f-met-ala- tRNAala dari tapak A ke tapak P dan (2) pergeseran posisi mRNA pada ribosom sepanjang tiga basa sehingga triplet kodon yang semula berada di tapak A masuk ke tapak P. Dalam contoh ini triplet kodon yang bergeser dari tapak A ke P tersebut adalah triplet kodon untuk alanin. Triplet kodon berikutnya, misalnya penyandi serin, akan masuk ke tapak A dan proses seperti di atas hingga translokasi akan terulang kembali. Translokasi memerlukan aktivitas faktor elongasi berupa enzim yang biasa dilambangkan dengan EF-G. Pemanjangan atau elongasi rantai polipeptida akan terus berlangsung hingga suatu tripet kodon yang menyandi terminasi memasuki tapak A, Sebelum suatu rantai polipeptida selesai disintesis terlebih dahulu terjadi deformilisasi pada f-metionin menjadi metionin.  yang kemudia berlanjut pada proses terminasi.

Pengakhiran (termination)

Translasi akan berakhir pada waktu salah satu dari ketiga kodon terminasi (UAA,UGA,UAG) yang ada pada mRNA mencapai posisi A pada ribosom. Dimana RF1 yang mengenali kodon UAA atau UAG sehingga rantai kodon tersebut akan terlepas, kemudian RF2 akan mengenali kodon UAA atau UGA sehingga rantai kodon tersebut terlepas. Proses terminasi ditandai oleh terlepasnya mRNA, tRNA di tapak P, dan rantai polipeptida dari ribosom. Selain itu kedua subunit ribosompun memisah, pada terminasi diperlukan aktivitas dua protein yang berperan sebagai faktor pelepas atau releasing factors, yaitu RF-1 dan RF-2 yang bekerja sama dengan RF-3.

 
Tinggalkan komentar

Ditulis oleh pada 7 Mei 2011 in Biomolekuler

 

Tag: , , , , ,