RSS

Arsip Tag: replikasi pada eukariotik

Replikasi Pada Eukariotik

Model-Model Replikasi

Replikasi atau perbanyakan asam nukleat dilakukan dengan dua cara yaitu replikasi dan transkripsi. Kedua proses tersebut digunakan satu utasan asam nukleat sebagai modelnya.Dalam proses replikasi perbanyakan satu molekul asam nukleat dilakukan dengan menggunakan dirinya sebagai model cetakan. Menurut pada ahli, ada tiga model replikasi DNA yaitu :

Model konservatif, Double helix parental tetap utuh, disampingnya dicetak molekul DNA baru
Model semikonservatif, Dua pita spiral dari double helix memisahkan diri, tiap pita tunggal dari double helix parental ini berlaku sebagai cetakan (template) untuk membentuk pita pasangan yang baru.
Model dispersif, Kedua pita dari double helix parental putus dibeberapa tempat kemudian dibentuk segmen-segmen DNA baru Selanjutnya potongan-potongan DNA parental dan DNA baru bersambungan dan menghasilkan dua double helix baru.

Gambar 1 : Tiga model replikasi

Pada tahun 1958 Matthew Meselson dan Franklin Stahl berhasil menunjukkan secara empiris bahwa replikasi DNA berlangsung dengan mekanisme secara semikonservatif. Meselson dan Stahl melakukan eksperimen untuk mengetahui mekanisme replikasi DNA dengan menggunakan bakteri Escherichia coli. Pertama kali, bakteri E.coli ditumbuhkan dalam medium yang mengandung nitrogen “berat” yaitu isotop ¹⁵N selama beberapa generasi. Dengan cara demikian maka molekul DNA induk mempunyai label berupa isotop berat sehingga molekulnya mempunyai densitas yang lebih tinggi dibanding DNA normal. Sel-sel yang molekul DNA-nya sudah berlabel tersebut kemudian dipindahkan ke medium baru yang mengandung isotop nitrogen yang “ringan“, yaitu ¹⁴N. Pada selang waktu tertentu setelah dipindahkan ke medium baru, sampel sel dipanen dan DNA-nya diisolasi. DNA hasil isolat tersebut kemudian disentrifugasi dengan ultrasentrifugasi gradien CsCl untuk menentukan densitas molekul DNA-nya. Hasil pengukuran densitas DNA yang diisolasi pada generasi pertama, semua DNA mempunyai densitas molekul hibrid, yaitu densitas yang dihasilkan oleh gabungan molekul DNA yang mengandung ¹⁵N dan ¹⁴N. Sebelum dipindahkan ke medium yang mengandung ¹⁴N ( yaitu generasi ke 0), kedua untaian DNA induk mengandung isotop ¹⁵N. Pada generasi kedua, densitas molekul DNA terdiri atas dua kelompok yaitu yang mempunyai densitas molekul hibrid dan yang mempunyai densitas lebih rendah dibanding dengan densitas molekul hibrid. Kelompok kedua tersebut terdiri atas molekul DNA yang kedua untaiannya mengandung isotop ¹⁴N.

Hasil eksperimen Meselson dan Stahl tersebut menunjukkan bahwa molekul DNA anakan terdiri atas satu untai DNA induk dan satu untai DNA hasil sintesis baru sehingga sesuai dengan model replikasi secara semikonservatif. Hasil eksperimen tersebut kemudian dikonfirmasi lagi dengan eksperimen kedua. Dalam eksperimen ini, molekul DNA hibrid didenaturasi dengan pemanasan pada suhu 100⁰C, kemudian disentrifugasi dalam gradien CsCl. DNA yang sudah didenaturasi tersebut menghasilkan dua pita DNA yang terdiri atas untai tunggal DNA yang mengandung ¹⁵N dan untai-tunggal DNA yang mengandung ¹⁴N. Berdasarkan atas eksperimen dapat disimpulkan bahwa replikasi DNA berlangsung secara semikonservatif.

Gambar 2: Semi konservatif (Masselson-Stahl)1958

Gambar 3: Percobaan Matthew Meselson dan Franklin

Komponen-Komponen penting Dalam replikasi. Replikasi bahan genetik ditentukan oleh beberapa komopen utama yaitu :DNA cetakan, yaitu molekul DNA atau RNA yang akan direplikasi. Molekul deoksiribonukleotida, yaitu dATP, dTTP, dCTP, dan dGTP.Deoksiribonukleotida terdiri atas tiga komponen yaitu:
1. Basa purin atau pirimidin
2. Gula 5- karbon (deoksiribosa)
3. Gugus fosfat
4. Enzim DNA polimerase, yaitu enzim utama yang mengkatalisis proses polimerase nukleotida menjadi untaian DNA. Pada eukariotik terdapat lima macam DNA polimerase yaitu DNA polimerase α, DNA polimerase δ, DNA polimerase ε, DNA polimerase β , dan DNA polimerase γ.
5. Enzim primase yaitu, enzim yang mengkatalisis sintesis primer untuk memulai replikasi DNA.
6. Enzim pembuka ikatan untaian DNA induk, yaitu enzim helikase dan enzim lain yang membantu proses tersebut yaitu enzim girase
7. Molekul protein yang menstabilkan untaian DNA yang sudah terbuka, yaitu protein SSB (single strand binding protein)
8. Enzim DNA ligase, yaitu suatu enzim yang berfungsi untuk meyambung fragmen-fragmen DNA
9. Syarat-Syarat Terjadinya Replikasi
10. Titik awal replikasi

Proses replikasi selalu dimulai pada wilayah tertentu yaitu titik awal replikasi (ori). Molekul DNA yang dapat bereplikasi atau mengandung titik ori disebut replikon , kromosom E.coli : Satu titik ori (Ori C), Plasmid F : dua titik ori (Ori V, ori T), Kromosom Eukariot : Lebih dari satu titik ori, Kromosom mitokondria : dua titik ori.

1. Utas ganda (double helix)

Untuk berlangsungnya proses replikasi diperlukan adanya asam nukleat berutas ganda (double helix). Adanya dua utas polinukleotida serta perpasangan antiparalel antara basa-basanya, memungkinkan satu utasan dari DNA tersebut menjadi model untuk utasan yang lainnya.

2. Sintesis DNA mempunyai arah pertumbuhan 5 ke 3

Proses sintesis DNA dua nukleotida digabungkan satu dengan lain dengan cara merangkaikan karbon gula kelima (C5) yang mengandung fosfat dari satu nukleotida kepada karbon gula ketiga (C3) yang mengandung OH dari nukleotida lain.

3. Replikasi berjalan secara bertahap

Proses replikasi berlangsung dua kejadian:

Penguraian helix ganda menjadi utasan tunggal
Sintesis rantai baru dengan menggunakan utasan tunggal tersebut sebagai model yang sekaligus menjadikan helix ganda yang utuh.

Pada percabangan replikasi terdapat 2 cabang yang berbeda ujungnya yaitu :

Ujung 3 OH (cabang “Leading”)

Arah sintesis berjalan dari ujung menuju pangkal percabangan, maka sintesis berjalan secara kontinu sejalan dengan proses penguraian pilinan heliks ganda. Pada replikasi DNA, untaian pengawal (leading strand) ialah untaian DNA yang disintesis dengan arah 5’→3′ secara berkesinambungan. Pada untaian ini, DNA polimerase mampu membentuk DNA menggunakan ujung 3′-OH bebas dari sebuah primer RNA dan sintesis DNA berlangsung secara berkesinambungan, searah dengan arah pergerakan garpu replikasi.

Ujung 5 P (cabang “Lagging”)

Sintesis dimulai pada pangkal percabangan dan bergerak ke ujung cabang, maka setiap saat pergerakan penguraian helix ganda akan muncul titik awal baru yang diikuti oleh sintesis dengan arah ke bagian luar cabang

Pada utas “lagging” sintesis berjalan secara diskontinu, dan akan ditemukan fragmen, Fragmen Okazaki (Reiji Okazaki, 1969)

Lagging strand ialah untaian DNA yang terletak pada sisi yang berseberangan dengan leading strand pada garpu replikasi. Untaian ini disintesis dalam segmen-segmen yang disebut fragmen Okazaki. Pada untaian ini, primase membentuk primer RNA. DNA polimerase dengan demikian dapat menggunakan gugus OH 3′ bebas pada primer RNA tersebut untuk mensintesis DNA dengan arah 5’→3′. Fragmen primer RNA tersebut lalu disingkirkan (misalnya dengan RNase H dan DNA Polimerase I) dan deoksiribonukleotida baru ditambahkan untuk mengisi celah yang tadinya ditempati oleh RNA. DNA ligase lalu menyambungkan fragmen-fragmen Okazaki tersebut sehingga sintesis lagging strand menjadi lengkap.

Garpu replikasi

Garpu replikasi atau cabang replikasi (replication fork) ialah struktur yang terbentuk ketika DNA bereplikasi. Garpu replikasi ini dibentuk akibat enzim helikase yang memutus ikatan-ikatan hidrogen yang menyatukan kedua untaian DNA, membuat terbukanya untaian ganda tersebut menjadi dua cabang yang masing-masing terdiri dari sebuah untaian tunggal DNA. Masing-masing cabang tersebut menjadi “cetakan” untuk pembentukan dua untaian DNA baru berdasarkan urutan nukleotida komplementernya. DNA polimerase membentuk untaian DNA baru dengan memperpanjang oligonukleotida yang dibentuk oleh enzim primase dan disebut primer.

DNA polimerase membentuk untaian DNA baru dengan menambahkan nukleotida—dalam hal ini, deoksiribonukleotida—ke ujung 3′-hidroksil bebas nukleotida rantai DNA yang sedang tumbuh. Dengan kata lain, rantai DNA baru disintesis dari arah 5’→3′, sedangkan DNA polimerase bergerak pada DNA “induk” dengan arah 3’→5′. Namun demikian, salah satu untaian DNA induk pada garpu replikasi berorientasi 3’→5′, sementara untaian lainnya berorientasi 5’→3′, dan helikase bergerak membuka untaian rangkap DNA dengan arah 5’→3′. Oleh karena itu, replikasi harus berlangsung pada kedua arah berlawanan tersebut.

Dinamika pada garpu replikasi

Bukti-bukti yang ditemukan belakangan ini menunjukkan bahwa enzim dan protein yang terlibat dalam replikasi DNA tetap berada pada garpu replikasi sementara DNA membentuk gelung untuk mempertahankan pembentukan DNA ke dua arah. Hal ini merupakan akibat dari interaksi antara DNA polimerase, sliding clamp, dan clamp loader.

Sliding clamp pada semua jenis makhluk hidup memiliki struktur serupa dan mampu berinteraksi dengan berbagai DNA polimerase prosesif maupun non-prosesif yang ditemukan di sel. Selain itu, sliding clamp berfungsi sebagai suatu faktor prosesivitas. Ujung-C sliding clamp membentuk gelungan yang mampu berinteraksi dengan protein-protein lain yang terlibat dalam replikasi DNA (seperti DNA polimerase dan clamp loader). Bagian dalam sliding clamp memungkinkan DNA bergerak melaluinya. Sliding clamp tidak membentuk interaksi spesifik dengan DNA. Terdapat lubang 35A besar di tengah clamp ini. Lubang tersebut berukuran sesuai untuk dilalui DNA dan air menempati tempat sisanya sehingga clamp dapat bergeser pada sepanjang DNA. Begitu polimerase mencapai ujung templat atau mendeteksi DNA berutas ganda, sliding clamp mengalami perubahan konformasi yang melepaskan DNA polimerase.

Clamp loader merupakan protein bersubunit banyak yang mampu menempel pada sliding clamp dan DNA polimerase. Dengan hidrolisis ATP, clamp loader terlepas dari sliding clamp sehingga DNA polimerase menempel pada sliding clamp. Sliding clamp hanya dapat berikatan pada polimerase selama terjadinya sintesis utas tunggal DNA. Jika DNA rantai tunggal sudah habis, polimerase mampu berikatan dengan subunit pada clamp loader dan bergerak ke posisi baru pada lagging strand. Pada leading strand, DNA polimerase III bergabung dengan clamp loader dan berikatan dengan sliding clamp.

Gambar 4. Replikasi dua arah (bidirectional replication)

Replikasi DNA Eukariota

Pada eukariota, replikasi DNA hanya terjadi pada fase S di dalam interfase. Untuk memasuki fase S diperlukan regulasi oleh sistem protein kompleks yang disebut siklin dan kinase tergantung siklin atau cyclin-dependent protein kinases (CDKs), yang berturut-turut akan diaktivasi oleh sinyal pertumbuhan yang mencapai permukaan sel. Beberapa CDKs akan melakukan fosforilasi dan mengaktifkan protein-protein yang diperlukan untuk inisiasi pada masing-masing ori.

Berhubung dengan kompleksitas struktur kromatin, garpu replikasi pada eukariota bergerak hanya dengan kecepatan 50 pb tiap detik. Sebelum melakukan penyalinan, DNA harus dilepaskan dari nukleosom pada garpu replikasi sehingga gerakan garpu replikasi akan diperlambat menjadi sekitar 50 pb tiap detik. Dengan kecepatan seperti ini diperlukan waktu sekitar 30 hari untuk menyalin molekul DNA kromosom pada kebanyakan mamalia.

Sederetan sekuens tandem yang terdiri atas 20 hingga 50 replikon mengalami inisiasi secara serempak pada waktu tertentu selama fase S. Deretan yang mengalami inisasi paling awal adalah eukromatin, sedangkan deretan yang agak lambat adalah heterokromatin. Daerah sentromer dan telomer dari DNA bereplikasi paling lambat. Pola semacam ini mencerminkan aksesibilitas struktur kromatin yang berbeda-beda terhadap faktor inisiasi.

Seperti halnya pada prokariota, satu atau beberapa DNA helikase dan Ssb yang disebut dengan protein replikasi A atau replication protein A (RP-A) diperlukan untuk memisahkan kedua untai DNA. Selanjutnya, tiga DNA polimerase yang berbeda terlibat dalam elongasi. Untai pengarah dan masing-masing fragmen untai tertinggal diinisiasi oleh RNA primer dengan bantuan aktivitas primase yang merupakan bagian integral enzim DNA polimerase a. Enzim ini akan meneruskan elongasi replikasi tetapi kemudian segera digantikan oleh DNA polimerase d pada untai pengarah dan DNA polimerase e pada untai tertinggal. Baik DNA polimerase d maupun e mempunyai fungsi penyuntingan. Kemampuan DNA polimerase d untuk menyintesis DNA yang panjang disebabkan oleh adanya antigen perbanyakan nuklear sel atau proliferating cell nuclear antigen (PCNA), yang fungsinya setara dengan subunit b holoenzim DNA polimerase III pada E. coli. Selain terjadi penggandaan DNA, kandungan histon di dalam sel juga mengalami penggandaan selama fase S.

Mesin replikasi yang terdiri atas semua enzim dan DNA yang berkaitan dengan garpu replikasi akan diimobilisasi di dalam matriks nuklear. Mesin-mesin tersebut dapat divisualisasikan menggunakan mikroskop dengan melabeli DNA yang sedang bereplikasi. Pelabelan dilakukan menggunakan analog timidin, yaitu bromodeoksiuridin (BUdR), dan visualisasi DNA yang dilabeli tersebut dilakukan dengan imunofloresensi menggunakan antibodi yang mengenali BUdR.

Ujung kromosom linier tidak dapat direplikasi sepenuhnya karena tidak ada DNA yang dapat menggantikan RNA primer yang dibuang dari ujung 5’ untai tertinggal. Dengan demikian, informasi genetik dapat hilang dari DNA. Untuk mengatasi hal ini, ujung kromosom eukariota (telomer) mengandung beratus-ratus sekuens repetitif sederhana yang tidak berisi informasi genetik dengan ujung 3’ melampaui ujung 5’. Enzim telomerase mengandung molekul RNA pendek, yang sebagian sekuensnya komplementer dengan sekuens repetitif tersebut. RNA ini akan bertindak sebagai cetakan (templat) bagi penambahan sekuens repetitif pada ujung 3’. Hal yang menarik adalah bahwa aktivitas telomerase mengalami penekanan di dalam sel-sel somatis pada organisme multiseluler, yang lambat laun akan menyebabkan pemendekan kromosom pada tiap generasi sel. Ketika pemendekan mencapai DNA yang membawa informasi genetik, sel-sel akan menjadi layu dan mati. Fenomena ini diduga sangat penting di dalam proses penuaan sel. Selain itu, kemampuan penggandaan yang tidak terkendali pada kebanyakan sel kanker juga berkaitan dengan reaktivasi enzim telomerase.

Mekanisme Replikasi Pada eukariot

Proses replikasi genom pada eukariot dapat dibagi kedalam tahapan:

Pengenalan titik ORI (titik awal replikasi)

Titik awal replikasi dinamakan Ori C, dapat dikenali oleh enzim Dna A yang dihasilkan oleh gen dnaA (pada E.coli) Terdapat berbagai jenis DnaA dan jenis Ori pada berbagai organisme, sehingga Satu jenis DNA dari satu organisme belum tentu dapat bereplikasi pada organisme lain, karena tidak cocok Ori dengan Dna A.

Penguraian pilinan heliks ganda

Memutuskan ikatan hidrogen antara basa-basa dari utasan yang berpasangan, memisahkan kedua utasan pada heliks ganda
Mencegah utasan tunggal yang terbentuk berpasangan kembali membentuk heliks ganda
Melindungi dari kerusakan akibat enzim nuklease yang banyak terdapat dalam sel.
Semua pekerjaan ini dilakukan oleh enzim helikase, girase DNA, dan protein SSB (single strand Binding protein)

Helikase merupakan Kelompok protein yang berfungsi menghilangkan ikatan hidrogen heliks ganda dan memisahkan menjadi utas tunggal

Jenis-jenis helikase lain

– Helikase I (hasil gen tra I pada plasmid F) berperan dalam replikasi plasmid

– Helikase II, III.

Girase menghilangkan tegangan superheliks

Enzim ini merupakan topoisomerase tipe II berfungsi untuk menghilangkan tegangan pada superheliks positif dengan cara membuka pilinan kearah negatif. Girase disusun oleh 2 jenis subunit protein yaitu: Sub unit A oleh gen gyr A dan Sub unit B oleh gen gyr B

Protein SSB melindungi utas tunggal

Kelompok protein khusus menempel dan berasosiasi dengan DNA utas tunggal, melindungi DNA dari serangan nuklease, yang dapat menghalangi transkripsi.Peran utamanya: Menstabilkan dan melindungi utas tunggal yang terbentuk selama replikasi DNA, perbaikan DNA dan rekombinasi

Sintesis rantai polinukleotida baru

Proses penggabungan mononukleotida menjadi rantai, enzim yang berperan :

Polimerase RNA
Polimerase DNA
Ligase

Inisiasi Sintesis oleh polimerase RNA atau primase

Proses replikasi semua fragmen okazaki diawali oleh RNA primer. Selanjutnya polimerase DNA memperpanjang rantai yang sudah ada. RNA primer dibentuk oleh primase (dihasilkan oleh gen dnaG atau oleh polimerase RNA (hasil gen rpo).

Sintesis perpanjangan rantai oleh polimerase DNA

Bertanggung jawab atas proses sintesis DNA baru dengan cara membentuk ikatan fosfodiester yang merangkaikan C ke 5 satu nukleotida terhadap C ke 3 dari nukleotida lain.

Penyambungan berbagai fragmen okazaki menjadi satu rantai polinukleotida utuh.

Enzim ligase yang berperan untuk menyambung dua ujung rantai polinukleotida menjadi rantai yang lebih panjang.Ligase terdapat dimana-mana didalam sel dan bentuk berbeda-beda sesuai sumber energi yang dimanfaatkan.